蒼耳種子萌發(fā)對鹽脅迫和不同溫度的響應(yīng)

馬 杰

(重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，重慶 400047)

當(dāng)前，生物入侵已成為倍受關(guān)注的一個(gè)重要問題［1－2］，一些入侵生物已導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)危害。因此，對于入侵種應(yīng)足夠重視，以防止其破壞性地爆發(fā)而危害當(dāng)?shù)厣锒鄻有浴?/p>

蒼耳，俗稱蒼耳草、刺兒棵、蒼耳子、蒼浪子等，為菊科(Compositae，Asteraceae)蒼耳屬(Xanthium)一年生草本植物，原產(chǎn)于美洲和東亞，廣泛分布于歐洲大部和北美部分地區(qū)。蒼耳的果實(shí)10－11月成熟，果實(shí)表面密生鉤刺及細(xì)毛。作為一種入侵植物，它能很好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂?。另外，野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，刺蒼耳的果實(shí)成熟良好，能正常萌發(fā)，這為其居群的擴(kuò)散奠定了基礎(chǔ)。該植物果實(shí)較大，主要靠水流、動(dòng)物和人有意或無意地傳播而擴(kuò)散。在母株周圍，由于散落的種子較多，所以蒼耳翌年能形成團(tuán)塊狀的群體，局部郁閉度大。

蒼耳結(jié)實(shí)量大，對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，易于散布，各種環(huán)境都適宜生長，廣泛分布于我國南北各省，常生長于曠野山坡、旱地邊、鹽堿地及路旁，尤其在荒野路邊、田邊最多，也是部分地區(qū)草坪中常見闊葉雜草，目前正逐漸往農(nóng)田轉(zhuǎn)移，能給農(nóng)作物和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。

鑒于蒼耳的危害日趨嚴(yán)重的狀況，探討其生理生態(tài)適應(yīng)性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文在不同溫度和NaCl脅迫條件下，研究蒼耳種子的萌發(fā)特性及其幼苗抗逆性的變化，為進(jìn)一步探究其入侵機(jī)制及防治提供科學(xué)依據(jù)［3－10］。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年3月，在縉云山采集成熟的蒼耳(X.sibiricum)種子(29.65'N，106.49'E，Alt.，307 m)。采集后的果實(shí)置于室溫下晾干，清理后，存放在冰箱(4℃)備用。

1.2 種子萌發(fā)

在萌發(fā)試驗(yàn)之前，首先用1%雙氧水(H2O2)溶液對刺蒼耳種子進(jìn)行消毒，對消毒后的種子置于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，放于不同的萌發(fā)箱中進(jìn)行萌發(fā)檢測。將種子分別置于10、15、20、25、和30℃以及變溫15/25℃(night/day，12 h/d)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中適時(shí)加蒸餾水以保持濾紙濕潤。培養(yǎng)皿中墊2層濕潤的濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置30粒種子，重復(fù)3次。以胚根突破種皮作為種子的萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每24 h觀察與記錄1次，持續(xù)到不再有種子萌發(fā)為止(霉?fàn)€的種子視為無活力的種子)，萌發(fā)持續(xù)時(shí)間為40 d。

1.3 NaCl溶液處理

由以上試驗(yàn)得到最佳萌發(fā)溫度后，進(jìn)行鹽脅迫處理試驗(yàn)。種子消毒后，用不同濃度的NaCl溶液處理。分別測定種子在 0(對照)、10、50、70、100、和150 mmol/L NaCl溶液中的萌發(fā)率。每一組包含2×35粒種子(即2個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿有35粒種子)，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在試驗(yàn)過程中，適時(shí)添加NaCl溶液并更換濾紙，定時(shí)觀察記錄種子的萌發(fā)率。種子萌發(fā)后形成的幼苗(1～2 cm)被用來測定脯氨酸(proline)和丙二醛(MDA)的含量。

1.4 脯氨酸含量的測定

將NaCl處理后形成的幼苗取出，測定根長，然后放置于－20℃冰箱中保存以備脯氨酸測定之用。根據(jù)Bates等(1973)的酸性茚三酮法測定脯氨酸的含量，以μg/g fresh weight(FW)表示。取2 g樣品置于研缽中，加入80%的乙醇共10 mL(放少量石英砂及聚乙烯吡咯烷酮，PVP)研磨至勻漿，于80℃恒溫水浴中抽提20 min。然后3000 r/min離心15 min。取提取液2 mL，再加入2 mL冰醋酸和2 mL茚三酮試劑，混勻后在沸水浴上反應(yīng)15 min，冷卻后以80%的乙醇為對照，比色測定A515。再從脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出樣品液中脯氨酸的含量。脯氨酸含量(μg/g)=(C×VT)/(W ×V1)，其中:C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸濃度(μg/mL);VT為提取液總體積(mL);V1為提取液的加入量(mL);W為樣品質(zhì)量(g)。

1.5 丙二醛(MDA)含量的測定

將NaCl處理后獲得的幼苗取出，采用TBA法測定MDA的含量［4］，以μmol/g表示。取1 g樣品置于研缽中，加入5%三氯乙酸(TCA)共10 mL，研磨至勻漿，4000 r/min離心10 min。取提取液2 mL，加入0.6%的硫代巴比妥酸(TBA，溶于10%TCA中)溶液2 mL，混合后在沸水浴上反應(yīng)10 min(自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)氣泡開始計(jì)時(shí))，冷卻后3000 r/min離心15 min。取上清液分別在波長A450、A532和 A600下測定吸光值;以 μmol/g(fresh weight，F(xiàn)W)表示。MD濃度的計(jì)算公式為:MDA 濃度 =6.45(A532－A600)－0.56 A450。

2 結(jié)果

2.1 溫度處理對刺蒼耳種子萌發(fā)的影響

在不同溫度下，蒼耳種子的萌發(fā)率存在顯著差異(P＜0.05)。在試驗(yàn)溫度體系中，隨著溫度的升高，種子的萌發(fā)率提高。當(dāng)萌發(fā)溫度為10℃時(shí)，發(fā)芽率僅為21.1%;而當(dāng)溫度上升到30℃時(shí)，刺蒼耳種子的萌發(fā)率變?yōu)?1.1%;另外變溫(25/15℃)處理后，種子的發(fā)芽率為27.8%。試驗(yàn)結(jié)果表明:在試驗(yàn)的溫度體系中，30℃是最適宜于蒼耳種子萌發(fā)的溫度;變溫(15/25℃)對種子萌發(fā)無明顯的促進(jìn)作用(圖1)。

圖1 溫度對刺蒼耳種子萌發(fā)率的影響

2.2 氯化鈉對蒼耳種子萌發(fā)的影響

蒼耳種子的萌發(fā)率顯著地受NaCl溶液的影響。在25℃時(shí)，對照組(蒸餾水處理)的萌發(fā)率為84.3%，NaCl溶液濃度由0升高到10 mmol/L，種子萌發(fā)率由84.3%升高到88.6%。而隨著NaCl溶液濃度的繼續(xù)升高，種子萌發(fā)率反而下降。當(dāng)NaCl溶液濃度由10 mmol/L升高到150 mmol/L時(shí)，種子萌發(fā)率由88.6%降低到22.9%?？傮w上，隨NaCl溶液濃度的升高種子萌發(fā)率降低，與滲透脅迫程度呈負(fù)相關(guān)(圖2)。

2.3 幼苗脯氨酸含量

隨著NaCl溶液濃度的升高，蒼耳幼苗中脯氨酸的含量明顯增加，均高于對照組(以蒸餾水處理)。對照組中脯氨酸含量為149.5 μg/g，在滲透脅迫下，當(dāng)NaCl溶液濃度從0增加到70 mM/L時(shí)，幼苗脯氨酸含量從 149.5 μg/g增加到 489.3 μg/g。當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)升高時(shí)，由70 mM/L增加到100 mM/L時(shí)，幼苗脯氨酸的含量反而會(huì)降低，從489.3 μg/g 降低到295.9 μg/g，但仍然高于對照組(圖3)。

圖2 NaCl脅迫對蒼耳種子的萌發(fā)的影響

圖3 NaCl脅迫條件下蒼耳幼苗中脯氨酸的含量

2.4 幼苗丙二醛(MDA)含量

在NaCl脅迫條件下，隨著NaCl溶液濃度的升高，蒼耳幼苗中MDA的含量逐漸增加，均高于對照組(以蒸餾水處理)。當(dāng)NaCl溶液濃度從0增加到 50 mM/L時(shí)，幼苗的 MDA的含量從0.0080 μmol/g增加到 0.0103 μmol/g;當(dāng)濃度從50增加到70 mM/L時(shí)，MDA有含量從0.0103 μmol/g 降低到0.0096 μmol/g;當(dāng) NaCl溶液濃度繼續(xù)增加，從70增加到150 mM/L時(shí)，幼苗中的MDA又隨濃度的增加而增加，從0.0096 μmol/g增加到 0.0132 μmol/g(圖 4)。

3 討論

種子萌發(fā)特性是植物生活史中的一個(gè)重要特征，對于植物種的生存具有重要意義。環(huán)境因素及其種子本身的狀態(tài)對種子萌發(fā)的影響是植物生活史中的一個(gè)重要特征。

圖4 NaCl脅迫條件下蒼耳幼苗中丙二醛(MDA)的含量

溫度對刺蒼耳種子萌發(fā)有顯著的影響，是影響蒼耳種子萌發(fā)的重要因素之一。在萌發(fā)過程中，種子內(nèi)部進(jìn)行著一系列的生理生化反應(yīng)，其中包括一些重要的酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)受制于外界環(huán)境的溫度。在本試驗(yàn)中，隨著溫度的升高，種子的萌發(fā)率提高。在種子萌發(fā)過程中，在放置2 d后，種子則開始萌發(fā)，沒表現(xiàn)出休眠的特性。萌發(fā)溫度為10℃時(shí)，發(fā)芽率僅為21.1%，且胚芽長勢緩慢，說明溫度太低不利于蒼耳種子的萌發(fā);當(dāng)溫度上升到30℃時(shí)，蒼耳種子的萌發(fā)率變?yōu)?1.1%;而變溫條件下，蒼耳種子萌發(fā)率為27.8%。通過分析所試驗(yàn)的幾個(gè)不同溫度的萌發(fā)率，發(fā)現(xiàn)30℃最適宜刺蒼耳種子的萌發(fā)，且變溫處理對種子萌發(fā)沒有明顯促進(jìn)作用。

鹽分對非鹽生植物最普通和最顯著的效應(yīng)就是阻止生長。鹽分對植物生長的抑制機(jī)理是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的問題。不同鹽類和同一鹽類不同鹽濃度、不同植物和同一植物不同器官和不同發(fā)育階段、以及暴露于鹽漬條件下時(shí)間的長短都可以產(chǎn)生不同的結(jié)果，鹽分的抑制機(jī)理也不相同。本研究表明，NaCl脅迫對蒼耳種子發(fā)芽率有一定的影響。低濃度的 NaCl對刺蒼耳種子的萌發(fā)影響較不明顯，而高濃度鹽分則對種子萌發(fā)有顯著的抑制作用，甚至導(dǎo)致完全不萌發(fā)。而在種子萌發(fā)過程中，NaCl脅迫對蒼耳種子萌發(fā)各項(xiàng)生理指標(biāo)均有不同程度的影響。其中，NaCl脅迫對刺蒼耳種子萌發(fā)過程中芽和根的生長有明顯的抑制作用，這可能是NaCl脅迫導(dǎo)致外界培養(yǎng)溶液的水勢降低，細(xì)胞吸水困難，使得蒼耳的組織細(xì)胞出現(xiàn)生理性缺水。植物組織中脯氨酸含量在一定程度上反映了植株體內(nèi)的水分情況，因而可以作為植物缺水情況的參考性生理指標(biāo)。在高等植物處于脅迫因子的作用下時(shí)，脯氨酸是最常產(chǎn)生的滲透調(diào)節(jié)劑之一［10］。在不同的脅迫條件下，植物體內(nèi)游離的脯氨酸含量的增加量是不同的。從本試驗(yàn)的結(jié)果來看，NaCl脅迫對蒼耳幼苗脯氨酸含量變化有顯著影響。低濃度的 NaCl培養(yǎng)液處理的刺蒼耳幼苗的脯氨酸含量逐漸升高，脯氨酸含量提高也可能是蒼耳幼苗對 NaCl脅迫環(huán)境的一種適應(yīng)性生理效應(yīng)。高濃度的 NaC1培養(yǎng)液處理的蒼耳幼苗的脯氨酸含量則隨著NaCl濃度的升高而逐漸降低，這可能是由于NaCl脅迫使植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受到破壞，從而脯氨酸含量反而降低。鹽脅迫產(chǎn)生鹽害時(shí)，植物代謝失調(diào)，引起蛋白質(zhì)合成下降或脯氨酸氧化受阻，從而積累較多的游離脯氨酸，因此，可以認(rèn)為長期大量的游離脯氨酸的積累不僅是適應(yīng)鹽脅迫的策略，也是發(fā)生鹽害(鹽毒性)的表現(xiàn)。這與其他報(bào)道的研究結(jié)果相似［3，8］。

氯化鈉(NaCl)脅迫對植物危害的一個(gè)重要方面是對膜結(jié)構(gòu)和組成的影響。NaCl脅迫下對鹽敏感的植物膜系統(tǒng)先遭到破壞。而細(xì)胞膜是生物體細(xì)胞器與環(huán)境間的一個(gè)屏障，對保持生物體的正常生理生化過程的穩(wěn)定性具有十分重要的作用，所以植物細(xì)胞膜透性的變化是公認(rèn)的植物抗性生理指標(biāo)之一。植物組織中MDA含量可反映細(xì)胞膜受傷程度的大小。在鹽脅迫下，細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，因此，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的增加，NaCl處理后的蒼耳幼苗的MDA含量逐漸升高，這說明其細(xì)胞膜已受到一定程度的損傷，這可能是 NaCl在細(xì)胞中積累而導(dǎo)致高濃度的鹽分對膜表面的磷脂發(fā)生氧化。

綜上所述，溫度和NaCl溶液處理均會(huì)顯著影響蒼耳種子的萌發(fā)，較高溫度有利于種子萌發(fā)，并且NaCl脅迫對蒼耳種子的萌發(fā)有抑制作用，對幼苗的生長也有顯著的影響。此外，蒼耳種子耐鹽性較強(qiáng)，對生境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究蒼耳的入侵機(jī)理和入侵后對本地種的影響和防治奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步減少和防止蒼耳的擴(kuò)散具有現(xiàn)實(shí)意義。

［1］陳潤政，黃上志，宋松泉，等.植物生理學(xué)［M］.廣州:中山大學(xué)出版社，1998:291－292.

［2］李振宇，解焱.中國外來入侵種［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［3］孫志賓，齊興云，張洪濤，等.The effect of NaCl to the growth and osmotic regulation of Arabidopsis thaliana［J］.山東科學(xué)，2006，19(3):7 －14.

［4］張治安，張美善，蔚榮海.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2004:138－141.

［5］Bates L S，Walderen R P，Teare I D.Rapid determination of free proline for water stress studies［J］.Plant Soil，1973，39:205 －207.

［6］Bewley J D.Seed germination and dormancy［J］.Plant Cell，1997，9:1055 －1066.

［7］Lin C C，Kao C H.Effects of NaCl stress on H2O2metabolism in rice leaves［J］.Plant Growth Regulation，2000，30:151－155.

［8］Lin J P，Zhu J K.Proline accumulation and salt-stress-induced gene expression in a salt-hypersensitive mutant of Arabidopsis［J］.Plant Physiology，1997，114:591 －596.

［9］Vitousek P M，Dántonio C M，Loope L L，et al.Introduced species:a significant component of human－caused global change［J］.New Zealand Journal of Ecology，1997，21:1－16.

［10］Xu S J，An L Z，F(xiàn)eng H Y，et al.Effects of seasonal water stress on Ammopitanthus mogolicusin［J］.Journal of Arid Environments，2002，51:437 －447.