牡丹‘鳳丹’體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)1)

朱向濤

(浙江農(nóng)林大學(xué)，臨安，311300)

王 雁 彭鎮(zhèn)華

(國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所))

律春燕

(膠州市少海發(fā)展管理處)

鄭寶強(qiáng)

(國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所))

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)為芍藥科芍藥屬名貴觀賞和藥用木本花卉，花大而美，有“花中之王”的美譽(yù)［1］。牡丹的組織培養(yǎng)已經(jīng)有大量研究［2-7］，但尚未建立起一套完整的再生體系。體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、繁殖速度快、結(jié)構(gòu)完整、植株再生率高、不受季節(jié)影響等特點(diǎn)，是植物大規(guī)模無(wú)性繁殖的一種主要手段［8］，有關(guān)牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生的研究較少，且體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率較低［9-11］，對(duì)本研究材料‘鳳丹’來(lái)說(shuō)，僅在周秀梅［12］論文中有所研究，但體胚誘導(dǎo)率較低，僅為12.5%。本研究以‘鳳丹’不同發(fā)育時(shí)期的合子胚為材料，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)過(guò)程中不同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，研究適合牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，建立牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生體系，為牡丹體胚的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

根據(jù)‘鳳丹’花后天數(shù)，分別選取牡丹種子，采回后放入冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆?。分別以種胚、子葉、胚軸為外植體，種子采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院花卉中心試驗(yàn)基地。

無(wú)菌處理:牡丹種子剝?nèi)プ钔鈱颖砥ぃ米詠?lái)水沖洗2 h，洗去表面黏液，之后在超凈工作臺(tái)上用70%酒精滅菌30 s，無(wú)菌水沖洗3～5次，然后用2%Na-ClO滅菌20 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，之后用鑷子和解剖刀剝?nèi)∮着呓臃N到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。利用上述方法將胚接種在MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1上培養(yǎng)20 d左右，培養(yǎng)后切取胚軸和子葉作為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。

分別用花后80、90、100、110、120 d 的牡丹種子種胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，每個(gè)時(shí)期完成3次重復(fù)，采回外植體后立即進(jìn)行滅菌接種，先后分5次完成試驗(yàn)。

利用種胚、胚軸、子葉等不同外植體對(duì)體胚進(jìn)行誘導(dǎo)，研究不同外植體對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響，每種外植體完成3次重復(fù)，種胚培養(yǎng)如上述方法進(jìn)行，胚軸和子葉培養(yǎng)在種胚培養(yǎng)20 d后分別獲取進(jìn)行試驗(yàn)。

利用0、30、60、90、120 g·L-1等不同質(zhì)量濃度蔗糖浸泡種胚2 h，滅菌后接種到培養(yǎng)基上，觀察不同蔗糖質(zhì)量濃度處理對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響，每個(gè)質(zhì)量濃度完成3次重復(fù)。

采用3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，每個(gè)培養(yǎng)基組合完成3個(gè)重復(fù)，用花后110 d的種胚為外植體。每種培養(yǎng)基加入蔗糖30g·L-1，瓊脂7 g·L-1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)基配制與滅菌:種胚發(fā)育時(shí)期、不同外植體、不同質(zhì)量濃度蔗糖等因素對(duì)體胚誘導(dǎo)影響的研究均接種在 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30.0 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)20 d后轉(zhuǎn)到光暗交替(光照∶黑暗=12 h∶12 h)條件下培養(yǎng)，接種后70 d觀察試驗(yàn)結(jié)果。所有培養(yǎng)基的pH值為5.6～5.8。

培養(yǎng)條件及培養(yǎng)過(guò)程:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院花卉中心組培室，溫度20～25℃，光暗交替條件下，光照強(qiáng)度為 30～40 μmol·m-2·s-1。剛接種后在黑暗條件下培養(yǎng)20 d，之后轉(zhuǎn)入光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每周觀察1次種胚的生長(zhǎng)情況，及時(shí)剔除污染植株并記錄。每隔30 d轉(zhuǎn)接1次。

培養(yǎng)1周后觀察外植體污染情況，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算污染率和褐化率，誘導(dǎo)70 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生體細(xì)胞胚的外植體的數(shù)目，統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率，所有數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用spss17.0針對(duì)胚發(fā)育時(shí)期、不同外植體、蔗糖處理不同時(shí)間等因素對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的影響進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)育時(shí)期對(duì)‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

不同發(fā)育時(shí)期種胚的發(fā)育情況不同，從表2可以看出，部分種胚接種到培養(yǎng)基后無(wú)明顯生長(zhǎng)，保持原有胚的形態(tài)不變，隨著種胚成熟度的增加，無(wú)生長(zhǎng)的現(xiàn)象逐漸降低，在花后120 d和花后110 d種胚無(wú)生長(zhǎng)現(xiàn)象較低。污染數(shù)量隨生長(zhǎng)期延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，花后80 d的外植體污染數(shù)最多，而花后120 d的外植體無(wú)污染。不同時(shí)期種胚生長(zhǎng)的部位不同，隨著種胚成熟度的增加，胚根伸長(zhǎng)的個(gè)數(shù)都有所增加，在花后110 d胚根伸長(zhǎng)數(shù)達(dá)到最大。而在花后80 d，胚根伸長(zhǎng)數(shù)最少。子葉生長(zhǎng)數(shù)量隨著花后時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，在花后110 d子葉生長(zhǎng)數(shù)達(dá)到最大，而花后80 d子葉生長(zhǎng)數(shù)最小。體胚誘導(dǎo)數(shù)隨著花后生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在花后110 d達(dá)到最高，誘導(dǎo)數(shù)為13.00個(gè)，而在花后80 d體胚誘導(dǎo)數(shù)僅為5.00個(gè)?？梢婓w胚誘導(dǎo)選擇發(fā)育時(shí)期在花后110 d的種胚誘導(dǎo)效果最好，體胚發(fā)生率最高，為33.00%。每個(gè)發(fā)育時(shí)期都能誘導(dǎo)出體胚，但不同時(shí)期誘導(dǎo)率有所差異。

表2 合子胚的發(fā)育時(shí)期對(duì)‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

方差分析可以看出，體胚發(fā)生率與發(fā)育時(shí)期具有一定的相關(guān)性，體胚發(fā)生率隨著種胚成熟度的增加而增加，在花后100、110、120 d 3種成熟度體胚誘導(dǎo)率沒(méi)有顯著性差異，而花后80、90 d體胚發(fā)生率差異性不顯著，但花后80 d和90 d與其他3個(gè)時(shí)期體胚發(fā)生率差異性顯著。從表2可以看出，花后100 d為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的界限，體細(xì)胞胚發(fā)生率在100 d前后呈現(xiàn)顯著性差異，因此，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中，選擇花后100 d以后的種胚更有利于體細(xì)胞胚發(fā)生，而相比較而言，110 d的種胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的個(gè)數(shù)最多，因此，選擇花后110 d的種胚最好。

2.2 外植體類型對(duì)牡丹‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

外植體類型不同體胚誘導(dǎo)效果有所不同，總體上來(lái)看，利用種胚、胚軸和子葉均能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，但誘導(dǎo)率差異顯著(表3)。

表3 外植體類型對(duì)‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

從表3可以看出，3種不同的外植體類型，體胚誘導(dǎo)率有所不同，總體上看，種胚的體胚誘導(dǎo)率最高，而胚軸的誘導(dǎo)率次之，子葉的誘導(dǎo)率最低，最高誘導(dǎo)率為33.00%，而最低的誘導(dǎo)率為8.00%。方差分析可以看出，種胚的體胚誘導(dǎo)率與其他2種外植體的差異顯著，而胚軸和子葉的體胚誘導(dǎo)率差異不顯著。在利用種胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的過(guò)程中，利用種胚直接誘導(dǎo)要好于利用胚軸和子葉進(jìn)行誘導(dǎo)。

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，種胚在產(chǎn)生體細(xì)胞胚的過(guò)程中會(huì)發(fā)生顏色和形態(tài)的變化，最初將胚接種在培養(yǎng)基上時(shí)，胚呈現(xiàn)白色，2片小子葉緊密結(jié)合(圖1A)，之后胚2片小子葉開始慢慢開口(圖1B)，此時(shí)，胚顏色仍為白色，之后在培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)的作用下，胚的體積逐漸增加，子葉開始慢慢長(zhǎng)大，而胚根部位慢慢變粗，整個(gè)胚的顏色仍為白色，但顏色稍微加深，呈現(xiàn)乳白色(圖1C)，之后，隨著生長(zhǎng)子葉的邊緣呈現(xiàn)淺紅色斑點(diǎn)，而在子葉的基部呈現(xiàn)淺綠色，整個(gè)胚呈現(xiàn)淡黃色(圖1D-E)。之后種胚的子葉部分開始變綠，而胚軸部分只是增粗，顏色未發(fā)生變化，仍然為白色，子葉不斷伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)到一定程度后，停止伸長(zhǎng)靠近培養(yǎng)基的一片子葉生長(zhǎng)緩慢，遠(yuǎn)離培養(yǎng)基的一片子葉生長(zhǎng)較快，胚基部出現(xiàn)淺紅色或白色透明愈傷組織(圖1F)，此時(shí)可以進(jìn)行胚軸和子葉分離分別培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在胚軸部位開始出現(xiàn)體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)(圖1G-H)。對(duì)種胚經(jīng)過(guò)20 d培養(yǎng)后形成的組織(圖1I)進(jìn)行切割，將胚軸和子葉分開培養(yǎng)，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。結(jié)果表明，胚軸和子葉在接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后，容易形成愈傷組織(圖1J)，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)一步形成體細(xì)胞胚(圖1K-L)。

2.3 不同質(zhì)量濃度蔗糖預(yù)處理對(duì)牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

從表4可以看出，對(duì)照試驗(yàn)的體細(xì)胞胚發(fā)生率較低，隨蔗糖質(zhì)量濃度的提高，體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度為90 g·L-1時(shí)，體細(xì)胞胚的發(fā)生率達(dá)到最高的38.00%，而未經(jīng)蔗糖處理的體細(xì)胞胚的發(fā)生率為32.50%，方差分析可以看出，各種質(zhì)量濃度的蔗糖處理體細(xì)胞胚發(fā)生率的差異不顯著。但可以看出利用蔗糖預(yù)處理要比沒(méi)有經(jīng)過(guò)預(yù)處理的效果要好。因此，利用花后110 d的種胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚時(shí)，最好用90 g·L-1的蔗糖溶液處理2 h后再進(jìn)行接種，有利于促進(jìn)體細(xì)胞胚的產(chǎn)生。

2.4 培養(yǎng)基類型對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

從表5中可以看出，所有培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，但是不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的數(shù)量不同，誘導(dǎo)率差異較大，總體上看，2號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好，體胚誘導(dǎo)率達(dá)到38.33%，其次是3號(hào)培養(yǎng)基。而7號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最低，為15.83%。從方差分析可以看出，2號(hào)培養(yǎng)基與其他各培養(yǎng)基差異顯著。因此，2號(hào)培養(yǎng)基 MS+2，4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1是最佳培養(yǎng)基。其他各個(gè)培養(yǎng)基之間差異性不顯著。

表4 不同質(zhì)量濃度蔗糖預(yù)處理對(duì)‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

表5 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)牡丹‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

表6 各因素極差分析

從各因素極差分析表(表6)中可以看出，對(duì)于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率，3因素中極差最大的是A(培養(yǎng)基)因素，為0.102，因此，為主要影響因素，而 B(2，4-D)為次要影響因素，極差最小的是C(6-BA)，為0.036，影響因素效果最小。所以，不同培養(yǎng)基對(duì)牡丹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響效果最大，而影響因素最小的是植物激素6-BA。從最大值上看，A因素的第1水平、B因素的第2水平和C因素的第2水平值最大，從而得出，各種因素的最優(yōu)組合為A1B2C2。即各種因素的最佳組合是MS+2，4-D 2.0 mg·L+6-BA 2.0 mg·L-1，此組合為2號(hào)培養(yǎng)基組合。

對(duì)不同培養(yǎng)基的方差分析可以看出，3種培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基是最好的培養(yǎng)基，而DKW和WPM比MS效果稍差，且兩者差異不顯著，而MS與后2種培養(yǎng)基差異性極顯著。2，4-D的不同質(zhì)量濃度中，隨著質(zhì)量濃度的提高，體胚誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度為2.0 mg·L 時(shí)效果最好，與其他2個(gè)質(zhì)量濃度存在極顯著差異。而6-BA的質(zhì)量濃度是3個(gè)影響因素中影響最小的，但是在不同質(zhì)量濃度的變化中依然有差異，在質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時(shí)效果最好，與其他2個(gè)質(zhì)量濃度存在極顯著差異。

圖1 體細(xì)胞胚形成過(guò)程

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，3種外植體中，種胚的誘導(dǎo)率最高，是最適合誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的外植體。有關(guān)牡丹組的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)前人也有研究，何桂梅［13］利用‘連鶴’‘島錦’花后70 d的胚進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率均在30%以下，而利用‘鳳丹’誘導(dǎo)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率僅為10%，本試驗(yàn)結(jié)果誘導(dǎo)率更高。

Shin J H et al. 利用芍藥的種胚在常規(guī)培養(yǎng)基MS上預(yù)培養(yǎng)后，取子葉做外植體，在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得了不同的誘導(dǎo)效果。不同的培養(yǎng)基對(duì)子葉誘導(dǎo)效果有所不同，誘導(dǎo)率也有較大差異，因此，針對(duì)不同的外植體采用不同的植物激素和基本培養(yǎng)基組合，篩選合適的培養(yǎng)基是有必要的。

利用質(zhì)量濃度為90 g·L-1的蔗糖溶液處理種胚2 h，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效果最好。前人有多次利用蔗糖預(yù)處理外植體而提高體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的研究，Biahoua A et al.［15］研究不同類型的糖對(duì)歐洲衛(wèi)矛體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響表明，蔗糖作為重要的滲透調(diào)節(jié)物對(duì)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和發(fā)育都有重要作用。Zhou S J et al.［16］對(duì)北美人參進(jìn)行蔗糖預(yù)處理，能夠提高體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率，減少畸形胚發(fā)生的概率，主要原因可能是蔗糖處理后的高滲透壓使細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象發(fā)生，從而促進(jìn)體細(xì)胞胚的產(chǎn)生，具體原因有待進(jìn)一步研究。而 Sujatha M et al.［17］對(duì)向日葵的體胚發(fā)生研究也發(fā)現(xiàn)，隨蔗糖質(zhì)量濃度升高，體胚誘導(dǎo)率提高，以質(zhì)量濃度為120～210 g·L-1的誘導(dǎo)率最高。對(duì)向日葵體胚分化最合適的蔗糖質(zhì)量濃度是120～180 g·L-1，高于 180 g·L-1或低于 120 g·L-1的體胚均發(fā)育慢。達(dá)克東等［18］對(duì)蘋果離體葉片進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)認(rèn)為，在碳源供應(yīng)充足的情況下，適當(dāng)降低蔗糖質(zhì)量濃度有利于直接體胚的發(fā)生。由前人研究可以看出，不同的植物對(duì)蔗糖處理的反應(yīng)不同，本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用質(zhì)量濃度為90 g·L-1的蔗糖處理浸泡牡丹種胚2 h對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效果最好。

幾種培養(yǎng)基中，MS是最適合誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基。WPM培養(yǎng)基和DKW培養(yǎng)基是中等養(yǎng)分的培養(yǎng)基，其中NH4NO3的質(zhì)量濃度較低，是適合木本植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，后2種培養(yǎng)基對(duì)牡丹體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)作用不理想，這說(shuō)明牡丹體細(xì)胞胚培養(yǎng)可能需要高質(zhì)量濃度的NH4NO3，但是高質(zhì)量濃度的NH4NO3不利于培養(yǎng)外植體的酚類物質(zhì)的擴(kuò)散，這可能是在MS培養(yǎng)基上褐化相對(duì)嚴(yán)重的原因，尤其是在子葉和胚軸培養(yǎng)上，效果更明顯，在完整體胚的培養(yǎng)上，由于沒(méi)有對(duì)外植體進(jìn)行切割，所以褐化的情況較少。

本試驗(yàn)以2，4-D和6-BA2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)為基礎(chǔ)，按照不同質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行設(shè)計(jì)，均誘導(dǎo)產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，但誘導(dǎo)率有差異，試驗(yàn)結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基是合適的培養(yǎng)基，而在2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量濃度均為2.0 mg·L-1時(shí)，體胚誘導(dǎo)率最高。

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