紫丁香葉中丁香苦苷和橄欖苦苷的質量分數(shù)1)

趙明 韓晶 單喜臣 王 丹 王金蘭 張樹軍

(齊齊哈爾大學，齊齊哈爾，161006)

木樨科丁香屬植物紫丁香(Syringa oblata Lindl)收載于吉林省藥材標準，具有清熱解毒、利濕退黃等功效，用于治療急性痢疾、黃疸性肝炎、乙型肝炎、結膜炎等疾病。同時該植物有著繁茂的花序、獨特的芳香，并具有耐陰、耐寒、耐旱、適應性強等特點，已成為國內(nèi)外園林中不可缺少的花木，植物資源十分豐富。研究表明，紫丁香含有大量的丁香苦苷和橄欖苦苷等環(huán)烯醚萜類成分[1－3]，其中丁香苦苷對急性黃疸性肝炎具有較好的療效[4]，橄欖苦苷具有抗真菌、抗炎、抗病毒、抗氧化以及抗癌等活性[5]，因此，紫丁香是一種極具開發(fā)前景的優(yōu)良樹種。由于不同成分在植物體內(nèi)的含量與生長時間密切相關，為給適時采收并合理利用紫丁香植物資源提供科學依據(jù)，筆者對1 a中不同生長時間的紫丁香樹葉中丁香苦苷和橄欖苦苷的質量分數(shù)進行系統(tǒng)研究，探討了丁香苦苷和橄欖苦苷在紫丁香樹葉中的質量分數(shù)隨時間的變化規(guī)律。

1 材料與方法

實驗用紫丁香樹葉自2011年5月—2011年10月，每月5日和20日各采集1次，共采集12組樣品。對照品丁香苦苷從紫丁香樹葉中分離得到，橄欖苦苷從紫丁香樹皮中分離得到，分別經(jīng)半制備HPLC純化，并經(jīng)1H NMR，13C NMR譜鑒定結構，HPLC歸一化法分析丁香苦苷對照品純度為99.7%，橄欖苦苷對照品純度為99.5%。

分析儀器為:Sarturius BT 124S/BT 25S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，CN61M/SP－752紫外分光光度計(北京中西遠大科技股份有限公司)。HPLC用甲醇和乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余均為分析純。

色譜條件:Agilent 1200高效液相色譜儀(手動進樣器，四元泵，柱溫箱，VWD檢測器，美國Agilent公司)，Agilent Eclipse XDB－C18 色譜柱(4.6 mm×50 mm，5 μm);流動相 v(乙腈) ∶v(水)=20 ∶80，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量 5 μL，丁香苦苷和橄欖苦苷檢測波長0→3 min(356nm)、3→15 min(223nm)。

對照品溶液的制備:分別精密稱取對照品丁香苦苷8.0 mg，橄欖苦苷對照品10.0 mg，用甲醇制成0.2 g/L的對照品儲備液，低溫避光保存待用。

供試品溶液的制備:采用醇提和水提兩種方法。醇提法取適量干燥的樹葉，粉碎、研磨后精密稱定，混勻。然后稱取1.7 g，用150 mL甲醇在索氏提取器上回流提取4 h，回流液用等體積正己烷萃取3次，收集甲醇層濃縮至衡質量，精密稱取適量，配制合適質量濃度的甲醇溶液，過濾，低溫避光保存。水提法取適量干燥的紫丁香樹葉，粉碎、研磨后精密稱定，混勻。稱取12.0 g，用125 mL水煮沸保溫1 h，重復提取3次，過濾合并提取液，濃縮至約150 mL。用等量的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液液濃縮至衡質量，精密稱取適量，配制合適質量濃度的甲醇溶液，過濾，低溫避光保存。

線性關系考查:分別取丁香苦苷和橄欖苦苷對照品適量，精密稱定，分別用甲醇配制一系列質量濃度的溶液，用上述色譜條件對系列樣品分別進樣5 μL進行分析，并對各分析峰面積(Area)與其質量濃度(Amt)進行線性回歸，得到以下回歸方程，丁香苦苷:峰面積=1105.8991×丁香苦苷質量濃度+17.73806(r=0.99911)，線性范圍 0.16 ～0.80 g·L－1;橄欖苦苷:峰面積=4096.74229×橄欖苦質量濃度－4.56273(r=0.99908)，線性范圍0.20 ～0.80 g·L－1。

精密度實驗:選取質量濃度為 0.20、0.40、0.80 g·L－1的丁香苦苷和橄欖苦苷對照品溶液分別重復進樣6次，用上述的色譜條件測定丁香苦苷和橄欖苦苷的峰面積，計算日內(nèi)精密度，所得峰面積的相對標準偏差分別為1.64%和1.52%;再選取同樣質量濃度的丁香苦苷和橄欖苦苷對照品溶液，1 d進樣1次，連續(xù)進樣3 d，測定各對照品峰面積，計算日間精密度，所得峰面積的相對標準偏差分別為1.36%和1.26%。

重復性實驗:取紫丁香樹葉供試品，分別配制成10.0 g/L的甲醇溶液，用上述的色譜條件，進樣分析，測定丁香苦苷和橄欖苦苷的峰面積，考查其穩(wěn)定性。其峰面積的相對標準偏差分別為1.17%和1.10%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性實驗:取同一供試品溶液，用上述的色譜條件，分別于 0、2、4、8、12、24 h 測定丁香苦苷和橄欖苦苷的峰面積，考查其穩(wěn)定性。其峰面積的相對標準偏差分別為1.35%和1.44%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收率試驗:取已知質量濃度的同一批次的紫丁香樹葉樣品溶液(10.0 g/L，1.0 mL)9 份，分別按120%、100%、80%，3個目標質量分數(shù)，精密加入丁香苦苷對照品 16.1、13.4、10.7 μg;橄欖苦苷對照品 169.9、141.6、113.3 μg;每個質量分數(shù)平行 3份，分別用上述的色譜條件進樣分析，計算3個組分的加樣回收率，結果平均回收率分別為100.2%和102.2%;相對標準偏差分別為1.8%和1.3%。

樣品測定:精密稱取各樣品，分別配制成10.0 g/L的溶液，用上述的色譜條件進行測試，每組實驗平行進行3次，用外標法測試計算各測試樣品中丁香苦苷和橄欖苦苷的質量分數(shù)。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的的選擇

由于每種植物中都含有復雜的化學成分，提取溶劑不同，所得提取率以及被提取成分存在較大差別，對分析結果產(chǎn)生較大影響。丁香苦苷和橄欖苦苷都是糖苷類成分，具有較大的極性，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等強極性有機溶劑，也可以溶于水，因此選擇甲醇和水兩種強極性溶劑作為提取劑。但使用甲醇提取，會含有大量的油脂以及葉綠素等小極性成分，因此，通過正己烷萃取予以除去;水煮提取雖然不含有葉綠素等小極性成分，但會含有大量的可溶性無機鹽及糖類等成分，所以通過正丁醇萃取富集丁香苦苷和橄欖苦苷。使用不同溶劑對2011年5—10月份采集的紫丁香樹葉進行提取所得提取物的質量占干燥紫丁香樹葉的質量分數(shù)(提取率)如表1?？梢钥闯?，甲醇提取所得提取物的總量明顯高于水提。但由于不同溶劑提取物化學成分組成和質量分數(shù)存在很大差別，因此所得提取物的量多并不一定代表丁香苦苷和橄欖苦苷的提取率高，需通過分析其中兩種物質的質量分數(shù)才能確定。

表1 不同提取溶劑的提取率

2.2 色譜流動相的選擇

關于丁香苦苷的色譜分析流動相的選擇，王艷宏等[6]以v(甲醇)∶v(水)=30∶70為流動相獲得很好的分析效果，但在該條件下，丁香苦苷和橄欖苦苷的分離效果不佳，并且在甲醇—水體系流動相中增加水的比例，延長保留時間也難以實現(xiàn)好的分離效果(如圖1A)。因此，甲醇—水體系不適合作為同時分析丁香苦苷和橄欖苦苷的色譜流動相。參照文獻[7]，用乙腈替代甲醇，選擇v(乙腈)∶v(水)=20∶80作為同時分析丁香苦苷和橄欖苦苷的色譜流動相，雖然保留時間略有延長，但丁香苦苷和橄欖苦苷不僅得到很好分離，而且峰形窄且尖(如圖1B)。

圖1 丁香苦苷和橄欖苦苷在不同流動相時的HPLC分析結果

2.3 樣品分析結果

在上述確定的色譜條件下，分別對不同時間采集的紫丁香樹葉的甲醇提取物和水提物中丁香苦苷和橄欖苦苷的質量分數(shù)進行分析，結果如表2?？芍隙∠銟淙~中含有較多的丁香苦苷和橄欖苦苷，但丁香苦苷更多，多數(shù)季節(jié)質量分數(shù)超過橄欖苦苷的2倍;對于不同溶劑提取物，甲醇提取物中，無論是丁香苦苷還是橄欖苦苷的質量分數(shù)均比水提物高，并且由前面的結果可知提取率也是甲醇高于水。因此，分析紫丁香樹葉丁香苦苷和橄欖苦苷的質量分數(shù)，或者從中提取分離丁香苦苷和橄欖苦苷應優(yōu)先選擇醇提法。

表2 不同時間采集的紫丁香樹葉醇提物和水提物的HPLC分析結果

3 討論

3.1 丁香苦苷的質量分數(shù)隨生長時間的變化

在齊齊哈爾的氣候條件下，5月份正值樹葉開始萌發(fā)的芽期(或嫩葉期)，6月為快速生長期，7、8月為穩(wěn)定生長期，9月中下旬逐漸進入枯萎期。綜合表1和表2的結果可以看出，丁香苦苷的質量分數(shù)隨采集時間變化，在5月20日、6月20日和9月5日采集的樹葉中，丁香苦苷占干燥樹葉質量的百分比分別達到:8.28%、3.77%和3.82%，而在6月5日和7月5日出現(xiàn)2個最低值，分別為:1.04%和1.15%。該結果證明丁香苦苷的質量分數(shù)與紫丁香的生長存在密切關系。由于丁香苦苷味苦，并具有很強的抗菌、抗病毒等生物活性，所以推測在紫丁香植物體內(nèi)大量合成丁香苦苷，對植物生長的不同時期抵抗病蟲害的侵蝕起到重要作用。在樹葉的芽期，由于樹葉嬌嫩，容易遭受病蟲害的侵蝕，所以此時丁香苦苷的質量分數(shù)最高;6月初期正值樹葉的快速生長期，由于樹葉生長過快，受丁香苦苷的生物合成速度的限制，難以滿足樹葉中存在高濃度的丁香苦苷，所以造成在6月5日前后產(chǎn)生的第一個最低值;7月初正值種子快速生長期，植物體內(nèi)的大量營養(yǎng)物質用于種子的生長可能是造成7月5日前后丁香苦苷的質量分數(shù)出現(xiàn)第二個最低值的原因。正是由于紫丁香樹葉中常年維持較高濃度的丁香苦苷的存在，使得紫丁香植物很少有病蟲害發(fā)生。

3.2 橄欖苦苷的質量分數(shù)隨生長時間的變化

綜合表1和表2的結果還可以看出，在紫丁香樹葉中除丁香苦苷外，橄欖苦苷的質量分數(shù)也很高，并且隨著紫丁香樹葉生長時間不同，其質量分數(shù)變化規(guī)律與丁香苦苷相同，分別在在5月、6月中下旬和8—9月出現(xiàn)3個高峰期(在5月20日、6月20日和9月5日采集的樹葉中橄欖苦苷占干燥樹葉質量的百分比分別為:3.75%、0.90%和 1.16%)，而在 6月5日和7月5日出現(xiàn)2個最低值(分別為:0.08%和0.29%)。這表明橄欖苦苷同丁香苦苷一樣對在不同生長時期抵御病蟲害的侵蝕發(fā)揮一定的作用。但是，在苦味上，丁香苦苷比橄欖苦苷更苦;在生物活性方面，橄欖苦苷表現(xiàn)很強的抗菌、抗病毒等活性[5]，由此推測在紫丁香的生長過程中，可能是橄欖苦苷在抵御病害，而丁香苦苷則在抵御蟲害方面發(fā)揮重要作用(有待進一步研究)。也正是由于有這兩種物質大量存在，確保了紫丁香在生長過程中少受病蟲害的侵蝕。

此外，由于在結構上丁香苦苷為環(huán)狀環(huán)烯醚萜苷，而橄欖苦苷則是裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷，二者同屬環(huán)烯醚萜苷類，骨架結構存在近緣關系，在生物合成途徑上存在一定的相關性，在植物體內(nèi)可能隨著生長環(huán)境的變化，發(fā)生結構的轉化。

4 結論

紫丁香樹葉中同時存在大量的丁香苦苷和橄欖苦苷，其質量分數(shù)隨生長時間不同產(chǎn)生較大波動，但二者變化規(guī)律相近。在樹葉芽期(或嫩葉期)，丁香苦苷和橄欖苦苷的質量分數(shù)最高，分別占干燥樹葉質量的8.28%和3.75%;使用甲醇、乙醇等強極性有機溶劑提取紫丁香樹葉中的丁香苦苷和橄欖苦苷的方法優(yōu)于水提法;使用乙腈—水體系做流動相，在v(乙腈)∶v(水)=20∶80時，使用 Agilent Eclipse XDB－C18 色譜柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)進行HPLC分析，丁香苦苷和橄欖苦苷可以實現(xiàn)很好的分離。

[1]王丹丹，劉盛泉，陳英杰，等.紫丁香有效成分的研究[J].藥學學報，1982，17(12):951－954.

[2]張樹軍，張軍鋒，王金蘭.紫丁香樹皮化學成分研究[J].中草藥，2006，37(11):1624－1626.

[3]張樹軍，郭華強，韓晶，等.紫丁香籽化學成分研究[J].中草藥，2011，42(10):1894－1899

[4]劉磊，李桂英，楊海玲，等.丁香苦苷不同給藥途徑的藥物動力學研究[J].中醫(yī)藥學報，2010，38(1):96－99.

[5]Aziz N H，F(xiàn)arag S E，Mousa L A，et al.Comparative antibacterialand antifimgal effects of some phenolic compounds[J].Microbios，1998，93:43－54.

[6]王艷宏，李永吉，王艷芝，等.紫丁香葉中丁香苦苷的 RPHPLC 法測定[J].中草藥，2003，34(3):268－269.

[7]尉小慧，翟衛(wèi)峰，沈敏捷，等，HPLC法測定紫丁香樹葉中丁香苦苷的含量[J].上海中醫(yī)藥雜志，2008，41(12):80－82.