多層納米金修飾膜的HCG表面等離子體傳感器

袁 璐 楊玉琮* 方湘怡 梁曉慧(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 70600)

2(西安交通大學(xué)理學(xué)院實(shí)驗(yàn)物理中心，西安 710049)

多層納米金修飾膜的HCG表面等離子體傳感器

袁 璐1楊玉琮1*方湘怡2梁曉慧2
1(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710600)

2(西安交通大學(xué)理學(xué)院實(shí)驗(yàn)物理中心，西安 710049)

探索一種可以高密度固定抗原的新方法，并用于研究多層納米金修飾金膜表面包被抗原的新型人絨毛膜促性腺激素(HCG)表面等離子體共振(SPR)傳感器。3-巰丙基甲基二甲氧基硅烷(MPTMS)與納米金粒子(AuNPs)可通過Au-S鍵在傳感器金膜表面交替組裝形成三維網(wǎng)絡(luò)，膜表面空間結(jié)構(gòu)中的納米金經(jīng)靜電作用可吸附大量的小分子抗原HCG，從而獲得多層膜修飾的HCG免疫傳感器用于檢測抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。用所構(gòu)建的HCG傳感器，直接檢測不同濃度的anti-HCG抗體有良好的線性關(guān)系，且修飾兩層膠體金膜比修飾一層時抗體響應(yīng)的共振峰移動幅度提高了1.8倍，檢測下限降低至1.5 μg/mL。間接法測定了不同濃度的 HCG，其濃度與 SPR共振峰的位移呈負(fù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)通過修飾兩層膠體金膜大大提高了金膜表面固定抗原的量，提高了檢測抗體的靈敏度，并且進(jìn)而用競爭法可檢測HCG抗原而不需要用第二抗體進(jìn)行信號放大。有望用于臨床實(shí)驗(yàn)診斷。

自組裝納米金;MPTMS法;人絨毛膜促性腺激素;SPR免疫傳感器

引言

人絨毛膜促性腺激素(humanchorionic gonadotropin，HCG)，是妊娠期間胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，由兩個不同的亞基α、β，以非共價(jià)鍵連接組成。血尿中HCG濃度的測定在臨床中具有廣泛的應(yīng)用。包括:診斷早期妊娠、異位妊娠、先兆流產(chǎn)、唐氏綜合癥的產(chǎn)前篩查、妊娠滋養(yǎng)層疾病(葡萄胎、絨癌等)的診斷和檢測等;還可以作為一些腫瘤的標(biāo)志物(如睪丸癌、胚胎細(xì)胞瘤)［1－4］。目前的檢測方法主要有免疫放射法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、金標(biāo)免疫分析(GIA)、微粒子酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析、時間分辨免疫熒光分析法(TRFIA)等［5］，這些方法檢測的結(jié)果穩(wěn)定，特異性靈敏度高，但是都需要標(biāo)記，需要的標(biāo)本量大，且操作復(fù)雜費(fèi)時。

表面等離子體共振(surface plasmon resonance SPR)是一種利用金屬薄膜的光學(xué)耦合產(chǎn)生的物理現(xiàn)象。近年來，SPR技術(shù)是一種新興的生化檢測，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子間相互作用的檢測［6－8］。20世紀(jì)60年代，Otto和Kretschmann分別發(fā)明了用可見光激發(fā)表面等離子體的方法。1982年Nylander等首次將SPR技術(shù)用于免疫傳感器領(lǐng)域。1983年Liedberg等成功地將SPR用于IgG蛋白與其抗原的反應(yīng)測定。1990年BiocoreAB公司開發(fā)了首臺商品化 SPR儀器［9－10］SPR生物傳感器具有非破壞性、無需標(biāo)記、高靈敏度、操作簡單和實(shí)時在線檢測等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在微生物檢測、血液分析、DNA分析、抗原抗體分析、有毒氣體檢測等方面廣泛應(yīng)用［11－13］。本實(shí)驗(yàn)采用SPR技術(shù)來研究HCG免疫傳感器，以達(dá)尋求一種新的簡便檢測血液中HCG的方法。

免疫傳感器的制作基礎(chǔ)是抗原或抗體在金膜表面的固定。近年來研究傳感器表面固定生物分子的技術(shù)越來越多，其中最受歡迎的是利用金巰鍵固定含巰基的化合物，再通過偶聯(lián)劑將生物分子以共價(jià)鍵的形式連接于金膜表面［14－18］。但是此類方法的靈敏度有限，要檢測更小的生物分子還需要再應(yīng)用生物素親和素、納米金顆粒、酶等標(biāo)記物進(jìn)行放大來提高檢測的靈敏度［19－22］，如Yu等應(yīng)用 MUA巰基組裝的方法制備了SPR免疫傳感器芯片用于檢測腫瘤標(biāo)志物AFP，采用雙抗夾心法檢測的靈敏度不高，作者還利用了第二抗體來提高檢測的靈敏度［14］。近幾年來，基于納米金固定抗原抗體的方法越來越受到重視 因其具有良好的生物相容性和強(qiáng)的信號增強(qiáng)效應(yīng)［23－26］，從而在提高檢測靈敏度方面取得了一定的進(jìn)展。如Gan等人研制了多層納米金修飾的免疫傳感器(Au|{HL/AuNPs}n-anti-HCG)［22］，使得 HCG 的檢測范圍變寬(0.1 ～100 mg/L);Chen等人用MPTMS/Nanosilver方法構(gòu)建了ATP和R6G傳感器［27］，使 ATP和 R6G的檢測下限降低。層層組裝是靠2種分子間的作用力交替組裝到電極表面形成多層膜，進(jìn)而在其表面固定探針分子可有效提高固定量。為了提高檢測靈敏度，克服固定抗體方向性的限制，本實(shí)驗(yàn)研究了一種在傳感膜表面高密度固定抗原的新方法。實(shí)驗(yàn)通過金膜表面自組裝多層納米金形成空間三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來固定HCG抗原用于SPR檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

自行構(gòu)建的Kretschmann結(jié)構(gòu)波長調(diào)制型SPR生物傳感器，KQ-100KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、KYKY SBC-12型真空離子濺射儀(北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司)、人絨毛促性腺激素 HCG標(biāo)準(zhǔn)品(包括幾種不同濃度)、抗HCG抗體(50 μg/mL)和抗甲胎蛋白抗體(均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)、實(shí)驗(yàn)室自制15 nm和50 nm的膠體金溶液、2%MPTMS乙醇溶液、1%NaOH、牛血清蛋白(BSA)、丙酮、TBST溶液、無水乙醇等。實(shí)驗(yàn)室所用試劑均為分析純。所用水均為二次去離子水，所用緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS PH 7.4)。

1.2 方法

1.2.1 SPR生物傳感器的原理

實(shí)驗(yàn)采用的SPR生物傳感器基于Kretschmann-Raether衰減全反射配置，采用固定入射角在一定波長范圍(400～700 nm)內(nèi)對共振波長進(jìn)行測定。如圖1所示，入射光以合適的角度入射到超白玻璃條的一端上，并在玻璃條中不斷發(fā)生全反射，最后從超白玻璃條的另一端射出來。光線在經(jīng)過玻璃條表面鍍有金膜的區(qū)域時，會激發(fā)表面等離子波，當(dāng)入射光和表面等離子體波滿足一定條件時就會發(fā)生共振，此時便可觀察到SPR譜曲線。

工作原理是:通過待測物和固定在傳感器芯片上的配體分子特異性反應(yīng)，引起芯片金膜接觸的介質(zhì)介電常數(shù)的變化，折射率的變化引起反射光譜的移動，共振峰的移動值和樣品濃度存在對應(yīng)關(guān)系。

圖1 SPR傳感器系統(tǒng)的原理圖Fig，1 Schematic diagram of the established SPR sensor system

1.2.2 傳感器芯片的制備

芯片選用穩(wěn)定性好的金膜作為傳感膜，折射率與棱鏡相匹配的玻璃片作為基片?；謩e用去離子水、丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈?。將清洗好的基片放入KYKYSBC-12型真空離子濺射儀中，先鍍一層鉻2 nm厚目的是增強(qiáng)金原子的黏附力而不易脫落，最后在其上鍍一層50 nm厚的金膜。

1.2.3 傳感片金膜表面多層組裝膠體金

實(shí)驗(yàn)采用了MPTMS/AuNPs自組裝法在金膜表面組裝納米金，其原理如圖2所示。

圖2 膠體金自組裝原理圖Fig.2 Schematic showing the fabrication process of gold surface

將鍍好的金膜芯片浸入2%MPTMS乙醇溶液中組裝12 h，分別用無水乙醇、去離子水清洗后氮?dú)獯蹈珊笈萑?%NaOH溶液中2 h，同上方法清洗后氮?dú)獯蹈稍俅谓?%MPTMS乙醇溶液中交替組裝12 h，清洗吹干后在金膜上滴加配置好的膠體金溶液，室溫放置16 h。至此金膜上組裝了第一層納米金層。如上方法再交替浸泡在MPTMS和NaOH溶液中，可在金膜表面形{MPTMS/AuNPs}多層膜。本實(shí)驗(yàn)選用了直徑分別為 和 的膠體金溶液。

1.2.4 組裝好的傳感片上包被HCG抗原

在組裝了納米金的傳感片上直接滴加20 μL一定濃度的HCG，室溫下保濕放置2 h，用PBS緩沖液清洗3～5遍洗去未吸附的蛋白分子。最后在金膜表面滴加20 μL 1%BSA溶液，室溫下放置30 min，目的是將未吸附蛋白的膠體金表面位點(diǎn)封閉。用PBS緩沖液清洗后氮?dú)獯蹈?，得到修飾有人絨毛促性腺激素HCG的傳感器芯片Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG?？芍苯佑糜跈z測或者置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG SPR免疫傳感器檢測不同濃度的anti-HCG抗體

將已經(jīng)修飾了HCG抗原分子的傳感器芯片安置于光路系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)好光路先測定PBS緩沖液中的光譜，以此為初始位置，然后加樣。于傳感片表面滴加10 μL不同濃度的anti-HCG抗體溶液 37℃溫育30 min，使抗原抗體充分反應(yīng)，然后用 TBST溶液沖洗傳感器芯片去除非特異性吸附，然后用PBS緩沖液清洗，在相同的PBS環(huán)境下檢測并記錄SPR光譜圖。

1.2.6 檢測不同濃度的HCG標(biāo)準(zhǔn)品抗原

首先將10 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品抗原(濃度分別為 5、20、100、200 ng/mL)與一定濃度的 anti-HCG antibody混合后，37℃下溫育30 min，然后取混合液10 μL滴加在傳感片金膜表面，37℃下溫育30 min。反應(yīng)完全后TBST溶液充分清洗，在PBS緩沖液中測定SPR光譜，抗原抗體結(jié)合后其共振峰的位移與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在一定范圍內(nèi)成反比。

1.2.7 傳感片的再生

免疫傳感器的重要優(yōu)點(diǎn)之一就是可以反復(fù)利用。再生是將一定濃度的酸或堿溶液或者離子試劑破壞抗原抗體間的結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)利用Piranha試劑(98%H2SO4∶30%H2O2=3∶1)混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用。清洗時將混合液滴加于金膜表面約5 min，反復(fù)2～3次，洗脫掉金膜表面的生物蛋白。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠體金在SPR傳感器金膜表面的組裝及抗原的固定

圖3是金膜表面膠體金組裝不同階段的SPR光譜圖。在圖3中，曲線B和A之間的共振峰位移表示金膜表面介質(zhì)折射率發(fā)生變化，折射率的改變與金膜表面組裝的金膠體粒子有關(guān) 組裝第一層膠體金SPR共振波長移動約17 nm，曲線C和B之間共振峰的移動約10 nm，表示第二層膠體金組裝后的共振峰位移。共振波長明顯的移動說明金膜表面納米金顆粒的分布隨著修飾層數(shù)的增加越來越密集，由SPR光譜圖可直接監(jiān)測到納米金修飾的過程。曲線D相對于C的位移表示固定了HCG抗原后金膜表面折射率的變化，其共振峰移動幅度越大，則抗原固定量越多。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)組裝兩層膠體金吸附一定濃度的抗原后共振峰移動幅度大于組裝一層納米金后固定相同濃度抗原共振峰的移動值，其共振波長移動值分別為12和8。說明組裝兩層納米金包被抗原的量大。

圖3 金膜表面不同修飾步驟的SPR光譜圖(A:MPTMS自組裝;B:組裝第一層膠體金;C:組裝第二層膠體金;D:人絨毛膜促性腺激素HCG的固定)Fig.3 SPR spectra curvesin every step of modification on gold surface(A:assembly MPTMS;B:the fist layer of nano gold;C:the second layer of gold nano-particles;D:immobilization of the HCG antigen)

圖4 為組裝一層和兩層納米金時HCG傳感膜對不同濃度抗體的SPR響應(yīng)情況。結(jié)果顯示，修飾了兩層納米金薄膜的SPR傳感器對結(jié)合相同濃度抗體的響應(yīng)幅度大，即檢測的靈敏度高。這種組裝兩層納米金的方法不僅通過增加傳感器膜的表面積來吸附更多抗原，而且通過 MPTMS橋形成一種空間二維結(jié)構(gòu)，使得可以結(jié)合抗原的位點(diǎn)顯著增加并且更加牢固，從而可以大大提高檢測的靈敏度。在實(shí)驗(yàn)過程中，分別用15 nm和50 nm膠體金進(jìn)行組裝固定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用15 nm膠體金自組裝固定HCG抗原的量大。分析可能是50 nm膠體金顆粒體積過大，形成空間二維結(jié)構(gòu)時可以吸附蛋白分子的區(qū)域減少。因此本次實(shí)驗(yàn)選用修飾兩層15 nm膠體金來構(gòu)建Au|{MPTMS/AuNPs}2-HCG免疫傳感器進(jìn)行檢測。

圖4 組裝一層和兩層納米金的Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG傳感器對不同濃度抗體SPR響應(yīng)值的直方圖Fig.4 Histogram of the SPR singal shift responded by diferent Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG sensors after reaction with different concentration of anti-HCG antibody

2.2 不同濃度抗體的檢測

采用實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的Au{MPTMS/AuNPs}2-HCG表面等離子體共振免疫傳感器，對溶液中不同濃度的anti-HCG直接進(jìn)行檢測，結(jié)果示于圖5和圖6。

在圖5(a)中，曲線 B和 A之間的位移表示HCG抗原的固定量;曲線C和B間的位移表示BSA結(jié)合在金膜表面的量，用BSA封閉未結(jié)合抗原的膠體金表面位點(diǎn)，從而消除檢測抗體時的非特異性吸附作用。兩條曲線之間的距離越大說明未結(jié)合抗原的位點(diǎn)越多，相反若沒有移動說明抗原已經(jīng)將可結(jié)合的位點(diǎn)占據(jù)滿;曲線D相對于 C的位移，表示抗體與傳感器金膜表面探針抗原發(fā)生了特異性結(jié)合，從而使金膜表面折射率改變，SPR共振峰發(fā)生相應(yīng)的移動。如圖5(b)所示，制備好的HCG傳感器對抗甲胎蛋白抗體沒有信號響應(yīng)，說明該傳感器的特異性好。Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG傳感器芯片表面固定的抗原密度一定，抗體濃度越大則通過抗原抗體反應(yīng)共價(jià)結(jié)合在傳感膜表面的抗體的量越多，通過 SPR系統(tǒng)檢測到的共振峰移動幅度越大。

不同修飾層數(shù)的傳感膜檢測不同濃度抗體時所對應(yīng)的的SPR共振峰位移如下面圖6所示。兩種修飾膜的SPR檢測結(jié)果均顯示，隨著抗體濃度的增加，SPR共振峰移動的幅度相應(yīng)增大，SPR共振峰移動幅度與抗體的濃度變化之間呈近似線性關(guān)系;比較一層和兩層修飾膜對抗體的SPR響應(yīng)信號，結(jié)果兩層修飾膜下各個濃度抗體所檢測到的共振峰位移平均是一層修飾膜時的1.8倍，且抗體檢測的最低限降至 1.5 μg/mL。

圖5 兩層納米金修飾膜的HCG傳感器的特異性反應(yīng)。(a)兩層納米金修飾的Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG傳感器對anti-HCG的SPR響應(yīng)值(A:組裝兩層納米金;B:固定HCG抗原;C:BSA封阻;D:抗HCG抗體的結(jié)合反應(yīng));(b)兩層納米金修飾的HCG傳感器對抗甲胎蛋白抗體的SPR響應(yīng)(A:固定了HCG抗原且BSA封阻后;B:與抗甲胎蛋白抗體反應(yīng)后)Fig.5 The specific reaction of the two-layer nanoAU modified HCG biosensor.(a)the SPR spectra curve of two-layer Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG biosensor surface responsed to anti-HCG antibody(A:assembly two layers of gold nano-particles;B:immobilization of HCG antigen;C:blocking with BSA;D:incubation with anti-HCG antibody);(b)the SPR spectra curve of two-layer Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG biosensor surface responded to anti-AFP antibody.(A:immobilizing of HCG antigen and blocking with BSA;B:incubation with anti-AFP antibody)

圖6 不同修飾層數(shù)傳感膜anti-HCG antibody濃度與SPR響應(yīng)值的關(guān)系的比較Fig.6 theSPR signalshiftresponded by diferent Au|{MPTMS/AuNPs}n-HCG sensors.for detection varies concentration of anti-HCG antibody

2.3 間接法檢測不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品HCG

通過將相同體積的4個濃度 HCG標(biāo)準(zhǔn)品(5、20、100、200 ng/mL)與一定量的 anti-HCG抗體混合反應(yīng)后，再用傳感器膜表面的探針分子檢測，結(jié)果如圖7所示，待測的 HCG的濃度越大，SPR檢測到的共振峰的移動越小。標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線結(jié)果表明，SPR共振峰的位移與待測HCG的濃度成反比。因?yàn)榇郎yHCG標(biāo)準(zhǔn)品濃度越大，結(jié)合的抗體量就越多，從而剩下的可以與探針抗原結(jié)合的抗體越少，相應(yīng)傳感器表面可檢測到的抗體的SPR共振峰的移動幅度減小。

圖7 不同濃度HCG標(biāo)準(zhǔn)品的檢測Fig.7 The detection ofdifferentconcentration of HCG

實(shí)驗(yàn)過程中，每張傳感器芯片可以反復(fù)利用多次，如圖8所示，曲線B和A之間的距離σλ表示修飾了兩層納米金后固定的抗原量。曲線C表示用piranha液清洗后金表面固定的抗原被洗脫掉，共振峰回到組裝了兩層納米金的位置，說明傳感膜表面只剩下組裝的納米金層 可以再次用于固定.

圖8 傳感片的再生(A:組裝兩層納米金;B:固定HCG抗原;C:Piranha溶液清洗后)Fig.8 SPR spectra curves of regeneration of sensor chip(A:assembly two layers of nanoparticles;B:immobilized with HCG;C:washing with prianhan solution)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用MPTMS/AuNPs交替修飾的方法成功地在金膜表面組裝了兩層納米金，構(gòu)成的空間三維結(jié)構(gòu)納米顆粒層，增大了結(jié)合蛋白分子的量。膠體金顆粒大大提高了傳感器芯片膜的表面積，從而也使得固定蛋白分子的密度大大增加。而且實(shí)驗(yàn)中固定了HCG抗原，克服了以往固定抗體時容易阻礙抗原結(jié)合位點(diǎn)的問題。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用這種新的組裝工藝首次制備了 Au{MPTMS/AuNPs}2－HCG生物傳感器芯片，應(yīng)用于表面等離子體共振(SPR)技術(shù)，檢測了HCG抗原抗體特異性結(jié)合。該傳感器明顯增加了HCG的固載量，成功的檢測出不同抗體的濃度，提高了檢測抗體的靈敏度，使得抗體檢測下限降低至1.5 μg/mL。并且可用間接法檢測出不同濃度的HCG標(biāo)準(zhǔn)品。該生物傳感器有望應(yīng)用于HCG的臨床檢測中。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，SPR生物傳感器有操作簡單迅速、無需標(biāo)記、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在檢測生物分子中具有廣闊的前景。同時，尚需要不斷研究更多的提高靈敏度的方法來提高SPR傳感器的檢測效率。本次實(shí)驗(yàn)為改良SPR傳感器制備的技術(shù)及檢測HCG等小分子抗原提供了新的思路。但是，此次實(shí)驗(yàn)僅為新方法研究的初期探索階段，要應(yīng)用于臨床檢測還需要對間接法檢測抗原的靈敏度、檢測限、抗干擾性等繼續(xù)研究，需要進(jìn)行大量的臨床標(biāo)本測試。

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Surface Plasmon Resonance Based Immunosensor for Human Chorionic Gonadotropin Using Nano Gold Modified Substrate

YUAN Lu1YANG Yu-Cong1*FANG Xiang-Yi2LIANG Xiao-Hui2
1(Department of Clinical Laboratories，The First Hospital Affiliated to Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710600，China)
2(Experimental Physics Center，School of Science，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049，China)

To explore a new method of immobilizing human chorionic gonadotropin(HCG)antigen on gold surface with high density and develop a new type of surface plasmon resonance(SPR)－based immunoassay sensor modified with multilayer gold nanoparticles coated HCG antigen.Multilayer gold nanoparticles were assembled through Au-S binding on the gold surface to form a 3D-network structure，which can immobilize HCG antigen efficiently by electrostatic adsorption.Different concentration of anti-HCG antibody and HCG were detected by SPR system.The SPR signal shift was linearly related to the concentration of anti-HCG antibody.The SPR resonance wavelength shifted produced by two layers of gold nanoparticles was 1.8 times as a layer one after reaction with anti-HCG antibody.The detection limit was down to 1.5 ug/ml.The HCG antigen has been tested using inhibition assay and the SPR signal shift was negatively related to the HCG concentration.Multilayer assembly is an efficient method to immobilize much more HCG antigen to improve the detecting sensitivity.The concentration of anti-HCG antibody could be detected directly，and HCG antigen could be detected indirectly by this biosensor chip，which was simple，dynamic and did not need secondary antibody.The method was expected to be applied in clinical diagnostics.

self-assembly gold nanoparticles; MPTMS; human chorionic gonadotropin，HCG; SPR immunoassay sensor

R318

A

0258-8021(2012)05-0748-07

10.3969/j.issn.0258-8021.2012.05.015

2012-05-16，錄用日期:2012-06-08，

* 通信作者。E-mail:yyc1103@mail.xjtu.edu.cn