新一代重組人粒細胞集落刺激因子的工業(yè)化發(fā)酵、復(fù)性和純化

宋 爽 蔣文宏 蔣永平，，*(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 蘇州方舟生物醫(yī)藥研發(fā)中心，蘇州 56)

2(蘇州方舟基因藥業(yè)有限公司，蘇州 215126)

新一代重組人粒細胞集落刺激因子的工業(yè)化發(fā)酵、復(fù)性和純化

宋 爽1蔣文宏2蔣永平1，2，*1(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 蘇州方舟生物醫(yī)藥研發(fā)中心，蘇州 215126)

2(蘇州方舟基因藥業(yè)有限公司，蘇州 215126)

工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵、復(fù)性和純化突變型人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSFa)，并測定其體外生物學(xué)活性。利用定點突變和DNA重組技術(shù)獲得突變型G-CSF(rhG-CSFa)。通過40 L發(fā)酵罐發(fā)酵基因工程菌株獲得rhG-CSFa包涵體，經(jīng)過一系列透析后，通過離子交換柱和分子排阻層析進行純化，并使用高效液相色譜技術(shù)對純化后的rhGCSFa進行純度分析。利用G-CSF依賴細胞株(M-NFS-60)測定純化后的rhG-CSFa體外活性效價。結(jié)果表明，rhGCSFa表達量占全菌蛋白的31.2%，通過優(yōu)化復(fù)性條件，rhG-CSFa復(fù)性率達到11.36%，純化后rhG-CSFa的純度達到99.11%。體外活性實驗顯示，與野生型G-CSF相比，rhG-CSFa在相同濃度下能誘導(dǎo) NFS－60細胞株獲得更高的細胞增殖率。rhG-CSFa工程菌株能夠高表達rhG-CSFa，可用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)的rhG-CSFa具有較高的生物活性、穩(wěn)定性和純度。rhG-CSFa大規(guī)模生產(chǎn)的成功為該藥物未來的臨床運用打下了良好的基礎(chǔ)。

重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF);發(fā)酵;復(fù)性;純化;生物活性

引言

人粒細胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)是由人體內(nèi)皮細胞、單核細胞、巨噬細胞及成纖維細胞分泌的一種糖蛋白。它由174個氨基酸組成，能夠促進骨髓內(nèi)粒細胞前體的增殖、分化［1］。近年來研究表明，GCSF對于造血干細胞有著比較強的動員能力，因此在骨髓移植中有著廣泛的應(yīng)用［2］，但其對于造血祖細胞未見有直接的影響［3］。

野生型G-CSF復(fù)性率低、貨架期短，往往需要反復(fù)給藥，增加了患者的痛苦和治療成本。本實驗室采用累加和定點突變技術(shù)，成功表達出突變型人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSFa)。與野生型G-CSF相比，其N端增加了四個正電氨基酸殘基，并將Cys17突變?yōu)锳la17。因而提高了rhG-CSFa的復(fù)性率、增強了與受體的親和力，延長了血漿半壽期，提高了生物利用度和生物活性［4－5］。在 CTX處理的獼猴模型中，皮下注射新一代重組G-CSF(G-CSFa)和野生型G-CSF，可以顯著降低嗜中性粒細胞減少癥的程度和持續(xù)時間，用藥期間患猴中性粒細胞絕對計數(shù)(ANC)曲線呈雙峰模型。用藥7天時即出現(xiàn)第一個峰值，患猴ANC提高37%，顯著高于同等劑量的野生型G-CSF組，證明rhG-CSFa可以更快地提升白細胞計數(shù)，提示在臨床使用時可以大大降低嗜中性粒細胞減少的化療患者繼發(fā)感染的可能性。同時還發(fā)現(xiàn)，停藥后 rhG-CSFa組 ANC顯著高于CTX處理前水平，而野生型G-CSF組ANC很快下降至CTX處理后水平［6］。藥代動力學(xué)研究證明，rhG-CSFa具有更高的血漿穩(wěn)定性和生物利用度［4］。急性和亞急性毒理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rhG-CSFa用量達到臨床注射劑量的680倍時，沒有對小鼠造成明顯的毒副作用和死亡，而且仍能有效刺激中性粒細胞的生成［7］。長期毒理研究表明 rhG-CSFa對于大鼠沒有顯著的毒性和免疫原性作用［8］。正因為 rhGCSFa的穩(wěn)定性和安全性，所以其可以作為嗜中性粒細胞減少癥新一代的臨床治療藥物。本實驗主要研究rhG-CSFa的工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)、復(fù)性和純化，為rhG-CSFa的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

AKTAexplorer自動化純化系統(tǒng)(GE Healthcare，Buckinghamshire，United Kingdom)、40L發(fā)酵 罐 (New Brunswick Scientific，N.J.，USA)、CEPA-Z41工業(yè)化自動連續(xù)離心機(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，Lahr/Schwartzwald，Germany)、Waters 2695高效液相色譜儀(Waters，Milford，USA)、鹽 酸 胍 (guanidine-HCl，GdnHCl)、EDTA(Amresco公司)、GSSG(glutathione disulfide，Sigma-Aldrich公司)、GSH(glutathione，Sigma-Aldrich 公司)、尿素(urea，上海實驗試劑有限公司)、β-ME(β-巰基乙醇，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、MTT(Sigma-Aldrich公司)、Triton X-100(Sigma-Aldrich公司)、D-mannitol(Sigma-Aldrich 公司)E.coli M15菌株(kan抗性，QIAGEN公司)、pQE3(表達載體，QIAGEN 公司)、M-NFS-60(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的獲得

用帶有rhG-CSFa基因的 pQE3表達載體轉(zhuǎn)化E.coli M15菌株。篩選能夠穩(wěn)定地高表達rhG-CSFa的重組菌株作為工程菌，凍存于液氮中。

1.2.2 rhG-CSFa的發(fā)酵和包涵體洗滌

將在液氮甘油管中凍存的基因工程菌種接種于裝有20 mL LB培養(yǎng)基(含有Amp 50mg/L和Kan 25mg/L)的小試管中，37℃，200 r/min的條件下過夜培養(yǎng)，次日接種于裝有500 mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)至菌體OD600值達到所需要求后，將其作為一級種子液。

將40 L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific，USA)空罐滅菌后加入30 L培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L、酵母膏20 g/L、氯化鈉5 g/L)進行實罐滅菌。冷卻后將一級種子液接種于發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，維持溶氧(DO)在35% ～80%，37℃培養(yǎng)。當(dāng)菌體OD600達到5.3時，加入7 mM的 IPTG誘導(dǎo) rhGCSFa的表達。誘導(dǎo)1 h后，加入2 L已滅菌的5×培養(yǎng)基(蛋白胨100 g/L、酵母膏100 g/L、氯化鈉25 g/L)以補充營養(yǎng)。發(fā)酵過程中自動添加濃鹽酸(HCl)和氨水(NH3·H2O)，將發(fā)酵液pH維持在7.2左右。隨時調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，保證溶氧(DO)維持在30%以上。

發(fā)酵罐接種前取樣一次，并將此樣品作為后續(xù)比色測定菌密度(OD600)的參比溶液。接種后每隔1 h取樣一次，測菌體光密度(OD600)，誘導(dǎo)4 h后終止發(fā)酵，測定此時發(fā)酵液 OD600值。發(fā)酵液利用CEPA-Z41工業(yè)化自動連續(xù)離心機離心收集菌體，記錄菌體濕重。

收集的菌體用裂解緩沖液(Tris 50 mmol/L，EDTA 2 mmol/L、NaCl 100 mmol/L、Triton X-100 0.5%v/v、溶菌酶 1 mg/mL、pH8.0)重懸，4 ℃攪拌至黏稠，超聲波破碎菌體至不黏，離心(7 000 r/min，25 min)獲得包涵體，依次經(jīng)過尿素緩沖液(Tris 50 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、Urea 2 mol/L、pH8.0)和純水洗滌后得到較純的包涵體，－80℃保存，SDSPAGE檢測包涵體。

1.2.3 rhG-CSFa的復(fù)性和純化

將0.7 g rhG-CSFa包涵體溶于70 mL溶解液(Tris 50 mmol/L、GdnHCl 6 mol/L、EDTA 5 mmol/L、β-ME 1%v/v、pH 7.5)，避光攪拌 2 h，離心(13 000 r/min、7 min)，上清用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，稱重離心管底沉淀質(zhì)量。上清隨后于400 mL稀釋液(Tris 25 mmol/L、Urea 2.5 mol/L、EDTA 2.5 mmol/L、Tween-80 0.004%v/v、GSH 4 mmol/L、GSSG 0.4 mmol/L、pH 7.5)中緩慢稀釋，稀釋后的 rhGCSFa溶液于4℃下攪拌放置60 h。

從3 M尿素Tris-pH8.0緩沖液開始，逐步降低pH、尿素和鹽濃度對 rhG-CSFa進行透析復(fù)性。透析袋內(nèi)外體積比為1:10以上，依次用4L的 A液(Tris 50 mmol/L、pH7.5)和 B 液(NaAc 25 mmol/L、Tween-80 0.004%v/v、pH5.4)各透析 2 次，每次 24 h(4℃下攪拌)。復(fù)性結(jié)束后，蛋白液離心(10 000 r/min，10 min)，上清液用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，根據(jù)復(fù)性前后蛋白濃度和蛋白液體積估算復(fù)性率。

復(fù)性后的 rhG-CSFa通過 CM-Sepharose陽離子交換柱純化，所用平衡緩沖液為20 mmol/L NaAc-HAc(pH5.4)，上樣后用0～1 mol/L的 NaCl進行梯度洗脫。洗脫液超濾濃縮后使用1.5 L Superdex 75凝膠柱(prep grade)層析純化。以上純化工作均在AKTA Explorer自動化純化系統(tǒng)中完成。

1.2.4 MTT法檢測復(fù)性后rhG-CSFa的生物學(xué)活性

取對數(shù)期生長的 M-NFS-60細胞，分別加入不同濃度的蛋白溶液，以野生型G-CSF作為對照，設(shè)置 1、2、5、10、20、40、80、160、330、670 pg/mL 十個濃度梯度，每個濃度3組平行。培養(yǎng)40～48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，加入裂解液，混勻后記錄570 nm處吸光度值。

1.2.5 Western Blot鑒定 rhG-CSFa

rhG-CSFa單克隆抗體分泌細胞株由本實驗室前期研究篩選、保存［5］。單克隆抗體細胞株經(jīng)24孔板擴大至50 mL培養(yǎng)瓶，此時取10 mL細胞上清進行western blot鑒定。

rhG-CSFa包涵體、白細胞分化抗原透明質(zhì)酸結(jié)合域(CD44－HABD)以及純化后的 rhG-CSFa經(jīng)15%膠濃度的 SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印(恒流300 mA、70 min、濕轉(zhuǎn))至 PVDF膜上，膜在 2%BSA 的BST液中4℃封閉過夜，PBT液洗膜3次，每次10 min;與單克隆抗體細胞株培養(yǎng)上清 (一抗)于37℃下孵育 1 h，PBT液洗膜 3次，每次 10 min，37℃下在堿性磷酸酶(AKP)標記的羊抗鼠 IgG(二抗，用 PBS稀釋至1∶2000)中孵育1 h，PBT液洗膜3次，每次10 min，于顯色液(NBT/BCIP)中顯色，待條帶顯色后蒸餾水漂洗終止顯色。

1.2.6 rhG-CSFa蛋白純度分析

rhG-CSFa蛋白樣品經(jīng)過0.45 um的膜過濾后，精密量取 10 μL注入高效液相色譜儀(waters 2695)，通過 Delta-PAK C18柱進行梯度洗脫，流動相為A液0.1%三氟乙酸-水溶液，B液0.1%三氟乙酸－乙腈溶液。以流速為1 mL/min，梯度洗脫20 min(洗脫程序為，A液從10% ～30%，B液從90%～70%)，檢測波長220 nm，記錄色譜圖(本實驗委托蘇州大學(xué)衛(wèi)生與環(huán)境技術(shù)研究所檢測中心完成)。

2 結(jié)果

2.1 rhG-CSFa發(fā)酵以及包涵體洗滌

40 L發(fā)酵罐加入30 L培養(yǎng)基，當(dāng)OD600達到5.3時取樣一次，同時加入7 mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌體表達重組蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體，濕重約628 g。按上述方法洗滌包涵體后，包涵體濕重196 g。計算得到 rhG-CSFa包涵體產(chǎn)率約為31.2%。

發(fā)酵前后菌體SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1所示(M為標準蛋白 marker、1為 IPTG誘導(dǎo)前全菌、2為IPTG誘導(dǎo)后全菌、3為 rhG-CSFa包涵體、4為 rhGCSFa凝膠過濾后樣品、5為 CD44-HABD蛋白)，誘導(dǎo)前菌體(lane 2)未發(fā)現(xiàn)rhG-CSFa條帶，而誘導(dǎo)后菌體(lane 3)除正常菌體蛋白外，明顯可見 rhGCSFa條帶。結(jié)果顯示，所獲得的基因工程菌株能夠高表達重組 G-CSFa蛋白(rhG-CSFa)，適合作為rhG-CSFa工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的工程菌。

2.2 rhG-CSFa復(fù)性結(jié)果

逐步降低尿素的濃度對rhG-CSFa進行透析復(fù)性。復(fù)性結(jié)束后蛋白濃度為0.159 mg/mL，蛋白液pH=5.31，并且雜蛋白較少。根據(jù)如下公式計算，復(fù)性率為11.36%。

圖1 rhG-CSFa誘導(dǎo)表達和純化后樣品的SDSPAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis ofrhG-CSFa induction and purification

2.3 rhG-CSFa純化

純化后，rhG-CSFa純度達到98%以上，超濾濃縮后，rhG-CSFa的濃度達到0.3 mg/mL，蛋白液中加入5%的D-甘露醇(D-mannitol)，過濾除菌，分裝至安碚瓶中，長期儲存于4℃冷庫。

2.4 MTT法檢測復(fù)性后rhG-CSFa的生物學(xué)活性效價

野生型G-CSF(參考品)活性效價已知，為3.93×107IU/mL(1IU=0.8×10－11g)。根據(jù)公式計算，rhG-CSFa樣品(待檢樣品)活性效價為(1.23±0.473)×108IU/mL，高于野生型 G-CSF。結(jié)果如圖2。

活性效價計算公式:

2.5 Western blot鑒定

如圖3所示(M為標準蛋白 marker、1為 IPTG誘導(dǎo)前全菌、2為 IPTG誘導(dǎo)后全菌、3為 rhG-CSFa包涵體、4為rhG-CSFa凝膠過濾后樣品、5為陰性對照(CD44－HABD蛋白)，對純化后的 rhG-CSFa進行Western blot分析。結(jié)果表明，純化后的 rhGCSFa可以與特異的單克隆抗體結(jié)合。針對 rhGCSFa的單克隆抗體可以特異性地標記rhG-CSFa包涵體和純化后的 rhG-CSFa，而與 CD44－HABD(陰性對照)無反應(yīng)。表明經(jīng)過發(fā)酵、復(fù)性和純化后的rhG-CSFa具有抗原活性。

2.6 rhG-CSFa蛋白純度分析

圖2 野生型G-CSF以及rhG-CSFa體外活性比較Fig.2 A comparison of in vitro activity between wild-type G-CSF and rhG-CSFa

圖3 rhG-CSFa誘導(dǎo)表達和純化后樣品的western blot分析Fig.3 Western blot analysis of rhG-CSFa induction and purification

圖4 為高效液相色譜分析結(jié)果，測定rhG-CSFa在1.6min時為單一色譜峰，計算其純度為99.11%。

圖4 rhG-CSFa蛋白液在波長220 nm處的高效液相色譜圖譜(純度為99.11%)Fig.4 Analysis of the purity of rhG-CSFa by HPLC at UV wavelength 220 nm (theprotein purity is 99.11%)

3 討論

根據(jù)本實驗室前期實驗積累的數(shù)據(jù)(未發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)在連續(xù)培養(yǎng)時，IPTG誘導(dǎo)1 h后加入濃縮培養(yǎng)基，同時全程控制溶氧(DO)在30%以上、pH穩(wěn)定在7.2左右，能夠獲得最多的菌體和重組蛋白。pH過高和過低都不利于菌體的生長和重組蛋白的合成。發(fā)酵過程中用于控制pH值的酸和堿通常有HCl、NaOH和氨水，但要注意 NH+4不超過170 mmol/L［9］?；蚬こ叹纳L對發(fā)酵液中的溶解氧水平也有著較高的要求。當(dāng)溶氧(DO)在40%時，可滿足菌體生長和高效表達重組蛋白的需要。當(dāng)細菌在進入對數(shù)生長期后，為了滿足生長需要耗氧速度較快，此時若不增加溶解氧的供應(yīng)量，細菌將通過無氧酵解的途徑進行糖代謝，產(chǎn)生大量乳酸等有害代謝產(chǎn)物，抑制工程菌的生長，并產(chǎn)生大量雜蛋白，在影響目的蛋白表達量的同時增加純化的難度［10－11］。但溶氧不可過多，否則會產(chǎn)生氧中毒現(xiàn)象，影響菌體生長和蛋白表達［12］。所以在發(fā)酵過程中，嚴格控制發(fā)酵液pH和溶氧水平對于發(fā)酵的成功至關(guān)重要。另外，誘導(dǎo)后添加新鮮培養(yǎng)基(即連續(xù)培養(yǎng))可以顯著提高重組蛋白的表達。誘導(dǎo)前菌體大量擴增，消耗了大量營養(yǎng)物質(zhì)，因此，誘導(dǎo)后添加高濃度營養(yǎng)物質(zhì)可以增加各種養(yǎng)分的含量，最終提高重組蛋白的產(chǎn)量。

野生型G-CSF分子中存在5個半胱氨酸，構(gòu)成兩對二硫鍵。第17位的半胱氨酸殘基不參與二硫鍵的形成，然而在復(fù)性時它會參與形成分子間和分子內(nèi)二硫鍵，從而干擾正常二硫鍵的形成，進而大大降低野生型G-CSF的復(fù)性率。與野生型G-CSF不同的是，新一代rhG-CSFa的17位半胱氨酸氨酸殘基(Cys)突變?yōu)楸彼?Ala)，因此降低了二硫鍵錯誤的概率，最終提高了G-CSF的復(fù)性率。本實驗通過包涵體復(fù)性前后蛋白液的濃度來估算rhGCSFa的復(fù)性率。蛋白復(fù)性過程中主要有兩個步驟會產(chǎn)生沉淀，一是包涵體溶解后殘留一些不可溶的沉淀，二是在透析過程中會析出大量蛋白。之所以不采用復(fù)性過程中產(chǎn)生沉淀的質(zhì)量估算復(fù)性率，主要因為沉淀在離心后含水量較高而無法準確稱量，容易產(chǎn)生很大誤差，因此用透析前后溶液的蛋白濃度可以更真實地反應(yīng)復(fù)性率。

復(fù)性后用 CM-Sepharose陽離子交換柱能夠較好地純化rhG-CSFa，首先，離子交換柱能夠起到濃縮樣品的作用;其次，離子交換柱可以去除樣品中的內(nèi)毒素，使得rhG-CSFa的后續(xù)臨床研究以及未來的臨床運用成為可能。并且SDS-PAGE檢測結(jié)果也顯示，經(jīng)CM-Sepharose陽離子交換柱純化的樣品，雜質(zhì)較少，濃度較高。

雖然經(jīng)CM-Sepharose陽離子交換柱純化的樣品純度已經(jīng)較高，但是仍會殘留微量雜蛋白，這是因為它們與rhG-CSFa帶電荷相似，難以用離子交換柱分離純化。因此還需使用分子排阻層析技術(shù)(分子篩)對陽離子交換柱純化后的樣品進行進一步的精制，從而使帶電相同但相對分子質(zhì)量不同的蛋白分子得以分離純化。本課題使用Superdex 75凝膠柱(prep grade)，可以高效、快速地進行rhG-CSFa蛋白純化，能夠滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需求，從而為rhG-CSFa作為藥品的應(yīng)用提供了技術(shù)上的可行性。從圖4中可以看出，蛋白樣品純度較高(99.11%)，可以用于后續(xù)的細胞活性實驗和其他實驗。

應(yīng)用依賴hG-CSF的細胞株M-NFS－60作為檢測細胞株，通過 MTT法進行 rhG-CSFa體外細胞活性實驗。結(jié)果顯示，表達產(chǎn)物rhG-CSFa的體外活性效價為(1.23±0.473)×108IU/mL，高于野生型 GCSF，其ED50是野生型 G-CSF的2倍。結(jié)果與本實驗室前期實驗基本相符［6］，使用rhG-CSFa第7天時患猴ANC已顯著高于同等劑量的野生型G-CSF組，表明rhG-CSFa可以更快地提升白細胞計數(shù)，出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能與rhG-CSFa的ED50高于野生型GCSF有關(guān)，所以能夠更快地發(fā)揮生物學(xué)功能。

本課題成功地進行了新一代G-CSF的大規(guī)模發(fā)酵、復(fù)性和純化，并得到了比野生型 G-CSF生物活性高的G-CSFa，為該蛋白作為一種更有效的促進中性粒細胞藥品的臨床運用打下了良好的基礎(chǔ)。

［1］ Aglietta M，Montemurro F，F(xiàn)agioli F，et al.Short term treatment with Escheria coli recombinant human granulocyte-macrophagecolony stimulating factor prior to chemotherapy for Hodgkin disease［J］.Cancer，2000，88:454 －460.

［2］ Bischof RJ，Zafiropoulos D，Hamilton JA，et al.Exacerbation of acute inflammatory arthritis by the colony-stimulating factors CSF-1 and granulocyte macrophage (GM)-CSF: evidence of macrophage infiltration and local proliferation［J］.Clin Exp Immunol，2000，119:361 －367.

［3］ Thomas J，Liu Fulu，Link DC.Mechanisms of mobilization of hematopoietic progenitorswith granulocyte colony-stimulating factor［J］.Curr Opin Hematol，2002，9(3):183 －189.

［4］ Liu Xiaoxiao，Jiang Yongping.Pharmacokinetic study of a novelrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor in rats［J］.Chin Med Sci J，2010，25(1):45 －50.

［5］ Jiang Yongping，Jiang Wenhong，Dai Wei，et al.Effect of a mutant human granulocyte colony-stimulating factor，GCSFC17A-M，on leukopenia in mice and monkeys［J］.Proc Amer Assoc Cancer Res，2005，46:1185－1186.

［6］ Jiang Yongping，Jiang Wenhong，Qiu Yuchang，et al.Effect of a structurally modified human granulocyte colony stimulating factor，G-CSFa，on leukopenia［J］.J Hematol Oncol，2011，4(28):28－36.

［7］ 范潔，丁欣欣，蔣永平.新一代重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSFa)的臨床前急性毒性和亞急性毒性研究［J］.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2012，39(1):25－30.

［8］ Xia Fei，Zhang Qingyu，Jiang Yongping.Chronic toxicity of a novel recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in rat［J］.Chin Med Sci J，2011，26(1):20 －27.

［9］ Lau J，Tran C，Licari P，et al.Development of a high celldensity fed-batch bioprocess for the heterologous production of 6－ deoxyerythronolide B in Escherichia coli［J］.J Biotechnol，2004，110:95－103.

［10］ 王海波，歐俊杰，耿信篤.重組大腸桿菌生產(chǎn)rhG-CSF發(fā)酵工藝的研究［J］.寧夏大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，25(2):161－163.

［11］ 李武平，王志武，朱麗娜，等.分泌型重組人生長激素工程菌的高密度發(fā)酵［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2000，13(3):163－165.

［12］ Castan A，Nasman A，Enfors SO.Oxygen enriched air supply in Escherchia coli process:production of biomass and recombinant human growth hormone［J］.Enzyme Microb Tech，2002，30:847－854.

Large-Scale Production，Refolding and Purification of a Novel Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor

SONG Shuang1JIANG Wen-Hong2JIANG Yong-Ping1，2，*1
1(Biopharmaceutical R＆D Center，Chinese Academy of Medical Sciences＆ Peking Union Medical College，Suzhou 215126，China)
2(Fanzhou Biopharmagen Corporation，Suzhou 215126，China)

The aim of this work is to produce，refold，and purify rhG-CSFa in large scale and determine its bioactivity.Using site-direct and additional mutagenesis，a structurally modified derivative of human G-CSF termed G-CSFa was constructed and fermented in a 40 liter bio-reactor.The rhG-CSFa inclusion bodies were extracted and refolded by a serial dialysis.The refolded G-CSFa was then purified by an ion-exchange column and size-exclusive chromatography，and the purity of rhG-CSFa was then analyzed by HPLC.Purified rhG-CSFa was tested for its biological activity in vitro using a G-CSF-dependent cell(M-NFS－60)assays.The 31.2%expressed G-CSFa protein yield was achieved and 11.36% refolding yield was obtained after optimizing the protein refolding conditions. The purity of rhG-CSFa was 99.11% after purification. In vitro studies demonstrated that rhG-CSFa induced a much higher proliferation rate of M-NFS－60 cell lines than wild-type GCSF at the same concentrations.The large-scale of recombinant G-CSFa in M15 strain was expressed with high yield，purity，and its biological activity and stability was confirmed.The success of large-scale production of GCSFa facilitates the clinical application of this potential drug.

rhG-CSF;fermentation;refold;purification;bioactivity

R318

A

0258-8021(2012)04-0552-06

10.3969/j.issn.0258-8021.2012.04.000

2012-02-26，錄用日期:2012-04-18

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2009ZX09102-250)

*通信作者。E-mail:yjiang@biopharmagen.com