妥布霉素生物合成中磷酸鹽的調(diào)節(jié)研究

劉 平

（丹東市食品藥品檢驗所，遼寧 丹東 118002）

在慶大霉素生物合成過程中，高濃度磷酸鹽阻遏從葡萄糖至2-DOS（2-脫氧鏈霉胺）之間的轉(zhuǎn)氨酶，從而影響產(chǎn)抗單位[1]。

妥布霉素（Tobramycin）屬第二代氨基糖苷類抗生素，作用于細菌30S核糖體亞基，抑制菌體蛋白質(zhì)的合成，是廣譜高效力抗生素，在體外對多種細菌具有抗菌的活性，特別是對某些慶大霉素耐藥的綠膿桿菌活性更為顯著[2]。妥布霉素是黑暗鏈霉菌（S.tenebrariuys）發(fā)酵液中分離到的尼拉霉素（Nebramycin）復(fù)合物中的一個組分。尼拉霉素復(fù)合物其中主要組分為2、4、5′三個組分。組分5′為6”-O-氨甲酰妥布霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）。組分6（妥布霉素）可分別由組分4和組分5′經(jīng)水解制得[3]。目前，國內(nèi)妥布霉素產(chǎn)生菌主要產(chǎn)生組分2和組分5′兩個組分，由于提取、精制的步驟復(fù)雜，成本較高。為了提高菌株生產(chǎn)能力，降低妥布霉素生產(chǎn)成本，很多人已經(jīng)在菌種選育方面作了大量工作，但是對于CTB生物合成的調(diào)節(jié)機制研究很少，本文初步探討了磷酸鹽調(diào)節(jié)CTB生物合成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑暗鏈霉菌201-420（S.tenebrariuys201-420），總效價1143U/mL，CTB百分含量88.5%；檢定菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 63501）。

1.2 培養(yǎng)基（%）

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

高氏一號種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0，黃豆粉1.0，蛋白胨0.3，玉米粉0.5，酵母粉0.1，CaCO30.1。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

黃豆粉4.0，葡萄糖4.0，蛋白胨1.0，CaCO30.5，MgSO4?7H2O 0.4，MnCl20.03，F(xiàn)eSO40.005，ZnSO40.003，NH4Cl 0.1%，豆油1.0。

1.2.3 鑒定培養(yǎng)基

蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，K2HPO4 0.3，瓊脂2.2，pH 7.8～8.0。

1.3 效價測定方法

二劑量法（中國藥典2005年版）

1.4 細胞破碎方法

將發(fā)酵液離心收集菌體，洗滌，置-70°C冰箱反復(fù)凍融3次，用超聲波破碎儀破碎菌體。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 37h補加磷酸鹽對發(fā)酵效價的影響

見圖1。由圖1可以看出，37h補加低濃度磷酸鹽時，有促進產(chǎn)生抗生素的作用，而當(dāng)最終的作用濃度達到0.1%以上的時侯，效價就會顯著下降。磷酸鹽對各種抗生素合成的調(diào)節(jié)有不同的機制。所以，在下面的實驗中，作者考察了磷酸鹽調(diào)節(jié)CTB生物合成一種可能的機制。

2.2 高濃度磷酸鹽阻遏從2-脫氧肌醇到2-DOS之間的轉(zhuǎn)氨酶2-DOS是氨糖類抗生素重要的生物合成中間體，從葡萄糖至2-DOS的生物合成途徑中，如圖2，葡萄糖首先轉(zhuǎn)變成為2-脫氧肌醇，然后再經(jīng)過兩次氧化、氨基化作用，轉(zhuǎn)變成為2-DOS[4]。根據(jù)報道，在慶大霉素生物合成的過程中，高濃度的磷酸鹽阻遏了從葡萄糖到2-DOS之間的L-谷氨酰胺：青蟹-肌醇單酮轉(zhuǎn)氨酶。因而影響氨基化作用，進而影響產(chǎn)生抗生素[3]。在以下的實驗中，我考察了在CTB的生物合成過程中是否也存在相同的作用機制。

圖1 37h補加磷酸鹽對發(fā)酵效價的影響

2.3 高濃度磷酸鹽與氯霉素作用效果比較為了考察高濃度磷酸鹽的負調(diào)控作用是通過阻遏某種酶的合成還是抑制某種酶的活性，我比較了高濃度的磷酸鹽與氯霉素的作用效果，因為氯霉素是蛋白質(zhì)合成抑制劑，發(fā)酵37h，同時向發(fā)酵液中添加一定濃度的氯霉素和高濃度的磷酸鹽，若兩者對CTB生物合成的作用效果一致，則表明磷酸鹽是通過阻遏某種酶的合成而影響抗生素的合成。結(jié)果如圖2所示。由圖2中可以看出，氯霉素對菌體的生長沒有影響?？陕让顾睾透邼舛攘姿猁}對CTB生物合成的作用效果基本一致，這表明磷酸鹽是通過阻遏CTB生物合成過程中的某個酶的合成而起作用的。

圖2 高濃度磷酸鹽與氯霉素作用效果比較

2.4 高濃度磷酸鹽阻遏從2-脫氧肌醇到2-DOS之間的轉(zhuǎn)氨酶 為了考察磷酸鹽具體阻遏了CTB生物合成過程中哪一個步驟，我在發(fā)酵37hr，向發(fā)酵液中添加11.6 mmol/L的磷酸鹽，使抗生素的合成被抑制，并且在發(fā)酵73h，加入不同濃度由葡萄糖到2-DOS之間幾種可能的前體物質(zhì)或中間體。由表1看出：只有73h，加入30mmol/L以上的氨基葡萄糖。由此，可以推測同慶大霉素一樣磷酸鹽阻遏了。

表1 Specific antibiotic produced by phosphate repress cultures supplementedwith precursors and intermediates of the CTB biosynthetic pathway

3 結(jié) 論

通過上面的實驗，我們可以得出下面的結(jié)論：在發(fā)酵過程中加入5.75mmol/L以上磷酸鹽，對CTB的生物合成發(fā)生明顯的負調(diào)控作用。其原因可能是：磷酸鹽本身阻遏L-谷氨酰胺：青蟹-肌醇單酮轉(zhuǎn)氨酶的合成。從而影響了從葡萄糖合成2-DOS的氨基化作用。

[1] Obregon AM.Physioloical studies on getamicin：Phosphate repression of antibiotic formation[J].J Antibiotics,1994,47(12)：1442-1446.

[2] 張淑華,李蓉以,廖勇.國產(chǎn)妥布拉霉素和阿普拉霉素對綠膿桿菌體外抗菌活力的研究[J].抗生素,1986,11(3)：239.

[3] Koch,K.Nebramycin：seperation of the complex and identification of factor 4,5and 5’,J[J].Antibiotics,1973,26(12)：745-751.

[4] Rinehart KL Jr,Malik JM,Nystrom RF,et al.Biosynthetic incorporation of [1-13C] glucosamine(*)and [6-13C] glucose into neomycin,J[J].Am Chem.Soc,1974,96(5495)：2263-2265.