滋腎降糖丸對高脂小鼠模型胰島素敏感性的影響及其機(jī)制

肖永平 郭 彬 凌英蓉

（廣東省深圳市中醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518033）

2型糖尿病占糖尿病絕大多數(shù)，主要表現(xiàn)為胰島素抵抗。改善胰島素敏感性已成為2型糖尿病治療的關(guān)鍵[1]。目前提高胰島素敏感性的藥物主要為噻唑烷二酮類，但其副作用較大[2]。第一代噻唑烷二酮類如曲格列酮因肝臟毒性而退市，2010年10月，歐洲市場因羅格列酮的心臟毒性而宣布退市。中藥盡管直接降糖作用微弱，但副作用較小，在防治并發(fā)癥及改善胰島素敏感性方面可能具有一定的優(yōu)勢[3]。滋腎降糖丸為臨床作用應(yīng)用多年的經(jīng)典中藥復(fù)方，主要成分由黃芪、黨參、龜甲、三七、地黃、熟地、五味子、黃精、牛膝、牡蠣、骨碎粉等組成，主要功效為益氣養(yǎng)陰、調(diào)節(jié)血糖，滋腎壯骨[4,5]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方可調(diào)節(jié)血糖，但具體機(jī)制不是很清楚。本研究主要通過高脂飼喂的小鼠模型制作胰島素抵抗的模型，探討了滋腎降糖丸對胰島素敏感性的影響及其相關(guān)機(jī)制，從而為臨床相關(guān)用藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 食物和動(dòng)物

3周齡的C57BL/6J小鼠[SPF級, 合格證號SCXK（滬） 2007-0005]購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)在清潔級動(dòng)物房（溫度：（20±2）℃，濕度：（60±5）%，12h/12h晝夜交替光照）。動(dòng)物自由攝食。普通和高脂食物購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。普通食物含20.5%粗蛋白，4.62%粗脂肪，52.5%無氮提取物，4.35%粗纖維（總卡路里3.45 Kcal/g，12%卡路里為脂肪）。高脂食物含有18.8 %粗蛋白，16.2%粗脂肪，45.2%無氮提取物，3.98% 粗纖維（總卡路里3.79 Kcal/g，38%的卡路里為脂肪）。

表1 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4( Glut4)和GAPDH引物設(shè)計(jì)

表2 Changes of blood glucose,triglycerides,total cholesterol,insulin levels,and insulin index in high-fat fed mice after 4 weeks of treatment of ZSJT.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取剛斷乳的C57BL/6J雄性小鼠（12g左右）。實(shí)驗(yàn)分為5組：正常飼料組，高脂模型組，高脂模型加滋腎降糖丸（深圳中醫(yī)院藥劑科制備）大（400mg/kg/d）、小劑量組（200 mg/kg/d），高脂模型加非諾貝特組（200 mg/kg/d）。每組10只C57BL/6小鼠。測試藥用雙蒸水溶解，均按0.2ml/10g灌胃給藥，連續(xù)給藥4組，對照組服用相應(yīng)體積的雙蒸水。實(shí)驗(yàn)期間每周定期監(jiān)測體重，食物攝取量。實(shí)驗(yàn)后取血檢測血糖，血脂和胰島素水平，實(shí)驗(yàn)前禁食6h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剝離小鼠后肢肌肉組織，液氮瞬時(shí)冷凍后，儲存于－80℃冰箱備用。血糖、總膽固醇、甘油三酯用商業(yè)試劑盒進(jìn)行檢測 （北京中生北控股份有限公司）。血胰島素用ABC-ELISA試劑盒 （上海西唐生物科技有限公司）。胰島素敏感性指數(shù)計(jì)算為1/（空腹血糖×血胰島素），其值越大，敏感性越高。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

隨機(jī)取新鮮準(zhǔn)備的肌肉組織（n=6），總RNA用Trizol試劑提取。用大連寶生物工程有限公司TaKaRa的SYBR? Premix Ex Taq? II（TaKaRa Code：DRR081）試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR）。檢測在7500 Real Time PCR 系統(tǒng) （Applied Biosystems，美國）。程序設(shè)置為95℃×30sec，接著95℃×5 sec，60℃×34sec進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。所有的樣品測試三次。 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（Glut4）和GAPDH引物設(shè)計(jì)如下為（表1）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間采用單因素方差分析（ANOVA），之后用Newman–Keuls比較檢測其顯著性，P＜0.05視為具有顯著性差別。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 滋腎降糖丸對血糖、血脂、胰島素、胰島素敏感指數(shù)的影響高脂小鼠血糖、血膽固醇、血胰島素水平出現(xiàn)顯著升高，而胰島素敏感指數(shù)顯著降低（表2）。滋腎降糖丸大劑量顯著抑制血糖、血膽固醇和胰島素水平的增加，同時(shí)顯著增加胰島素敏感性指數(shù)。滋腎降糖丸小劑量組作用較弱。陽性藥物非諾貝特作用較強(qiáng)，顯著抑制血糖、血膽固醇和胰島素水平的增加，同時(shí)顯著增加胰島素敏感性指數(shù)。

2.2 滋腎降糖丸對肌肉Glut4基因表達(dá)的影響

和正常小鼠比較，高脂小鼠肌肉Glut4 mRNA的表達(dá)顯著降低，但滋腎降糖丸大、小劑量均顯著增加Glut4 mRNA的表達(dá)，且有一定劑量依賴關(guān)系。非諾貝特作用更強(qiáng)。見圖1。

3 討 論

圖1 Expression of Glut4 mRNA in muscles of high-fat fed mice after 4 weeks of treatment of ZSJT. aaP＜0.01 vs Normal; bbP＜0.01 ZSJT vs HFD; ccP＜0.01 Fenofibrate vs Normal. Normal，normal control mice; HFD，high-fat diet-fed control mice; ZSJT-400，Zhi-Shen-Jiang-Tang Pill(400mg/kg)-treated high-fat diet-fed mice; ZSJT-200，Zhi-Shen-Jiang-Tang Pill(200mg/kg)-treated high-fat diet-fed mice.

高脂小鼠通過一定時(shí)間飼喂后，將表現(xiàn)出胰島素抵抗的現(xiàn)象，是糖脂代謝紊亂的關(guān)鍵。改善胰島素敏感性是該疾病治療的關(guān)鍵。滋腎降糖丸為深圳市中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的中藥復(fù)方制劑，臨床研究發(fā)現(xiàn)，該藥具有調(diào)節(jié)血糖的作用，然而具體的機(jī)制不是很清楚。本研究中我們發(fā)現(xiàn)滋腎降糖丸適度控制血糖水平，盡管作用較弱，但顯著改善胰島素敏感性指數(shù)，降低體內(nèi)胰島素水平。Glut4是轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵因子，其表達(dá)增加將有可能增加葡萄糖的攝取，改善胰島素敏感性[6]。該研究表明滋腎降糖丸顯著增加Glut4的基因表達(dá)的作用，因而我們推測滋腎降糖丸改善胰島素敏感性的作用可能與此有關(guān)。盡管滋腎降糖丸作用較陽性藥物為弱，但副作用較小，因此在輔助治療方面仍將具有一定的應(yīng)用前景。特別指出2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征都有胰島素抵抗的特征，因此滋腎降糖丸在這一類疾病中可能具有廣泛的用途。

滋腎降糖丸具有改善胰島素敏感性的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)肌肉組織中Glut4的表達(dá)有關(guān)。

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