骨基質(zhì)明膠在異位成骨區(qū)的成骨研究

王瑞芳 秦書儉 田志逢

1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院基礎(chǔ)部解剖教研室，山西汾陽 032200；2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；3.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校解剖教研室，河南漯河 462002

骨折愈合是一個受多因素影響的復(fù)雜過程，其中骨折區(qū)的血液供應(yīng)對骨折愈合的效果起到非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同處理后的骨基質(zhì)明膠 （bone matrix gelatin，BMG）在兔股前內(nèi)側(cè)區(qū)的成骨效果，為臨床骨折修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康5月齡日本大耳白兔40只，體重1.5～2.0 kg，雌雄不限。

1.2 制備BMG

取4只日本大耳白兔四肢骨、髂骨，將四肢骨的骺端及髂骨參照Urist[1]的方法制備成6 mm×5 mm×4 mm大小的BMG。

1.3 BMG的植入

將36只日本大耳白兔隨機(jī)分為3組，10%水合氯醛腹腔麻醉后手術(shù)，在膝關(guān)節(jié)上方的股內(nèi)側(cè)區(qū)做一縱行切口，A組：BMG用2 μg/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）浸泡過后將隱動、靜脈游離 1 cm后順行植入；B組：將隱動、靜脈游離1 cm后植入未作任何預(yù)處理的BMG中；C組則直接將未處理過的BMG植入，不分離隱動、靜脈。術(shù)后肌內(nèi)注射4 萬U慶大霉素，1次/d，共注射7 d。

1.4 血管灌注

術(shù)后4、8、12周，每個時間點(diǎn)取各組動物4只，10%水合氯醛腹腔麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺上，暴露腹主動脈和下腔靜脈，結(jié)扎腹主動脈近心端，在其遠(yuǎn)心端做離心插管，往動脈內(nèi)注入大量肝素生理鹽水同時剪開下腔靜脈，直至靜脈遠(yuǎn)端流出清亮、透明、無色液體時為止。然后從腹主動脈注入配好的復(fù)合墨汁，觀察血管化情況，至下腔靜脈有墨汁回流，遠(yuǎn)端皮膚、甲下顏色變黑時結(jié)扎下腔靜脈，繼續(xù)灌入少量復(fù)合墨汁。放置24 h后取出植入物，再放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.5 HE和Masson染色組織學(xué)觀察及定量分析

將固定好的植入物行脫鈣、脫水、冬青油透明后石蠟包埋、作縱橫切片，厚度為5 μm，隨后進(jìn)行HE染色和Masson染色，倒置顯微鏡下觀察血管化及成骨情況。根據(jù)體視學(xué)德萊塞原理，參照空間內(nèi)某特征物的面積分?jǐn)?shù)是其體積分?jǐn)?shù)的估計(jì)，以Masson染色組織片中新生骨及血管的面積比來代表新生骨及血管化水平，在每個蠟塊標(biāo)本的上、中、下部分分別作連續(xù)橫向切片5 片，置于顯微鏡下，在CIAS-1000 細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)下測算其新生骨面積比及血管面積比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組別之間作方差分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；作新生骨面積比和血管面積比的線性相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)用r表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

術(shù)后4周，A組移植物中央有少量的血管 （圖1，見封三），B、C組的血管集中在材料邊緣。術(shù)后8周，A、B組移植物中央血管量增加，其中A組增加較B組多，兩組支架材料已經(jīng)開始降解吸收，在新生的血管周圍可見新生軟骨組織（圖2～3，見封三），C組無新骨形成。術(shù)后12周，A組材料大部分被新生軟骨和骨組織代替，新生血管排列較有序，B組新生血管趨向于有序排列（圖4，見封三），C組材料由大量纖維結(jié)締組織充填，新生血管集中在材料邊緣，并且排列紊亂。

2.2 新生骨面積定量分析

移植物新生骨面積比如表1 所示。表1 中可以看出，術(shù)后4周，A、B組與C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）；術(shù)后8周，A、B、C組之間互相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；術(shù)后12周，A、B組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

表1 移植物新生骨面積比比較（±s，%）

表1 移植物新生骨面積比比較（±s，%）

注：同一時間點(diǎn)與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

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2.3 新生骨面積比與血管化面積比相關(guān)分析結(jié)果

新生骨面積與血管面積圖像相關(guān)分析結(jié)果見圖5，r4周=0.53，P＜0.05；r8周=0.46，P＜0.05；r12周=0.61，P＜0.05。 表明新生骨面積比與血管面積比呈正相關(guān)。

3 討論

有研究表明，組織工程骨的成骨效果受局部血運(yùn)的影響，局部的血管化有助于組織工程骨的成骨，說明局部好的血運(yùn)對成骨具有重要的意義[2]。

血液循環(huán)的建立，是一切成骨機(jī)制的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)新生骨面積和血管化面積相關(guān)分析可以看出，各個時間點(diǎn)新生骨面積比與血管化程度均呈正相關(guān)，血管化程度越高，新生骨面積越大。王永剛等[3]認(rèn)為組織工程骨中央植入的血管束可以促發(fā)多中心成骨，不同于僅依靠周圍血管逐漸向材料中心長入，隨血管的長入而向心性成骨的單一漸進(jìn)性過程。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這種多中心成骨現(xiàn)象，其機(jī)制可能是血管束植入帶入的細(xì)胞在一定條件下可轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，促進(jìn)了移植物的成骨過程。骨性結(jié)構(gòu)在崩解的過程中，形成了骨形態(tài)發(fā)生蛋白調(diào)控因子[4]。移植物的成骨過程，可能通過膜性化成骨和軟骨化成骨兩種過程相輔相成得以實(shí)現(xiàn)。

Leunig等[5]研究發(fā)現(xiàn)，體外環(huán)境下，bFGF抑制軟骨細(xì)胞的分化。體內(nèi)環(huán)境中，由于bFGF的促血管化作用，對新骨的形成有促進(jìn)作用。在異位成骨中，bFGF可以通過增加新生血管的形成改善血供條件[6-7]。本實(shí)驗(yàn)中A組成骨效果好于B組，可能是因?yàn)锳組中加入的bFGF的促血管化作用加速了新生骨的形成。

細(xì)胞支架材料是組織工程學(xué)組織的基礎(chǔ)[8-10]。研究表明所用材料的性能和孔隙比促血管形成的生長因子對血管生長的影響更大。Pieper等[11]認(rèn)為生物材料良好的生物相容性減少了異物反應(yīng)，他們認(rèn)為異物反應(yīng)過程中炎癥細(xì)胞的作用和植入物表面形成的纖維包膜不利于血管的長入。本實(shí)驗(yàn)新生骨面積分析可見A、B、C三組在術(shù)后12周時的面積比均比同組8周時小，分析其原因可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用的支架材料BMG是同種異體材料，生物相容性好，所以容易被降解吸收，隨著血管化程度的不斷增高，新生骨也不斷地吸收改建，其吸收的速度大于新骨形成的速度，最終導(dǎo)致術(shù)后12周時新生骨面積比比術(shù)后8周時為小。金大地等[12]認(rèn)為BMG在脫鈣的基礎(chǔ)上經(jīng)過一系列處理，除去了磷蛋白、脂蛋白和蛋白多糖等大量非骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）物質(zhì)，再經(jīng)過冷凍處理，使其免疫原性降低，相對而言，BMP的純度相應(yīng)提高，而BMG的膠原結(jié)構(gòu)變得松散，容易被宿主吸收，使周圍新生血管及宿主細(xì)胞容易長入也是誘導(dǎo)成骨作用明顯的一個重要原因。在本實(shí)驗(yàn)新生骨面積比和血管化面積比的相關(guān)分析中也可以看出，血管化程度越高，新生骨面積越大，這和金大地等人的研究結(jié)果是一致的。

雖然BMG作為支架材料具有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BMG存在吸收過快的問題，如果要應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步改變生物學(xué)性狀，減慢其吸收速度。

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