肝門阻斷再灌注致腦皮層血管內(nèi)皮損傷中TNF-α和IL-10的變化

黃風怡 鄭曉春 李榮鋼 涂文劭

單一肝缺血再灌注(IR)可致腦損害［1］，臨床肝移植中也見術(shù)后血清S100β蛋白升高，提示血腦屏障(BBB)通透性發(fā)生改變［2］。肝門阻斷(Hepatic Protal Occlussion，HPO)再灌注損傷包含肝臟IR損傷和腸道淤血再灌注損傷，后者再灌注后血流恢復(fù)較缺血損傷更加緩慢。HPO對腦皮層血管內(nèi)皮和血腦屏障(BBB)的影響未見報道。本研究觀察HPO再灌注后血腦屏障的損害并探討機制。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性wistar大鼠，體重200～250 g，由福建醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心提供。室溫20℃ ～27℃，濕度40% ～60%，白天黑夜各12 h。全部動物均接受異氟烷(Isoflurane)持續(xù)吸入麻醉。尾靜脈穿刺置入24 g套管針并固定，連接三通后輸液，微量注射泵輸入乳酸林格氏液10 ml/(kg·h)。肝素500U/kg以0.9%生理鹽水稀釋成1 ml緩慢靜脈注射，注射時間不小于5 min。仰臥位固定四肢，燈照加溫，Datex多功能監(jiān)測儀(芬蘭)半導(dǎo)體溫度傳感器監(jiān)測直腸溫度，保持直腸溫37℃ ～38℃。RBP-1B型大鼠血壓計(北京)監(jiān)測尾動脈非創(chuàng)血壓。伊文思藍(Evans Blue，EB)為SIGMA公司產(chǎn)品，進口分裝，取2 g溶于100 ml大鼠血漿中，臨用前預(yù)熱至36℃。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 模型的制備 肝門阻斷模型:常規(guī)備皮消毒后取腹部正中切口入腹，離斷肝周韌帶以消除肝臟側(cè)支循環(huán)，以Pringle'法用無損傷小動脈夾于肝十二指腸韌帶處完全阻斷門脈、肝動脈及膽總管，使全肝缺血，暫時關(guān)腹。30 min后原路入腹松開血管夾恢復(fù)肝血供。觀察肝及腸管血供復(fù)流良好后關(guān)腹。肝門阻斷期間監(jiān)測血壓，必要時乳酸林格液擴容保持MAP不低于60 mm Hg。術(shù)畢關(guān)腹前腹腔內(nèi)注入含青霉素20萬U的溫生理鹽水1 ml。腹壁皮膚縫合后停止麻醉，保溫至蘇醒后歸籠飼養(yǎng)。術(shù)后自主飲用100 g/L葡萄糖水，至預(yù)定時間點取材。術(shù)中失血量超過2 ml者棄用。

1.3 實驗分組和標本取材 所有實驗對象隨機分成:①假手術(shù)組(Sham組):n=16，經(jīng)腹正中切口入腹，切斷全部肝周韌帶，不作肝血流的阻斷，縫合腹腔。6 h后處死取材。②肝門阻斷組(HPO組):n=16，Pringle'法阻斷全肝血流，30 min后復(fù)流再灌注，縫合腹腔。6 h后處死取材。

每組8例大鼠專門用于伊文氏藍(EB)腦組織滲透率和組織含水率測定。另外8例供取材:吸入麻醉后開腹，經(jīng)心尖取血4 ml，靜置10 min后4℃3600rpm離心15 min取上清，置于-20℃冰箱保存待測血漿腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-10(IL-10)濃度。取Tris韌帶下20 cm處取小腸5 cm，縱向剪開后用0-4℃生理鹽水沖洗干凈，黏膜朝上在濾紙上展平，待測髓過氧化酶(MPO)活性。然后斷頭-20℃冰玻上迅速取皮層腦組織，切取小塊1 mm3，2.5%戊二醛前固定，4℃保存過夜備電鏡檢查。最后取腦皮層和腸組織約0.5 g置于10%中性甲醛液中固定過夜。常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、HE染色、切片、40倍物鏡下觀察并攝像待測光鏡病理。

1.4 觀察指標和檢測方法

1.4.1 腦皮層光鏡病理及透射電鏡下血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)取前處理后的皮層1 mm3在1%鋨酸后固定2 h;50%1，70%1酒精梯度脫水;80%1，90%1，100%3丙酮脫水，浸透過夜;環(huán)氧樹脂812包埋，35℃、45℃、60℃聚合各24 h;瑞典公司LKB-Ⅴ超薄切片機切片;醋酸鈾-檸檬酸鉛染色;日立HITACHI H-600透射電鏡下觀察、診斷，攝影。

1.4.2 BBB通透性和腦皮層含水量的測定 每組單列一半大鼠(8例)處死前經(jīng)尾靜脈給與 EB(2 mg/kg，1 min內(nèi)推完)，30 min后用50 ml生理鹽水經(jīng)左心室灌注沖洗血液，經(jīng)心內(nèi)注入10%福爾馬林15 ml原位固定。取大腦沿冠狀切面切開，取位置相同的皮層組織約1 g勻漿后用分光光度計(吸收光譜635nm)檢測伊文氏藍含量。再取腦皮質(zhì)約200 mg，電子天平精確稱重兩次取均值后，置于紅外線烤箱，110℃恒溫烘烤24 h后稱干腦重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重100%。

1.4.3 腸黏膜損傷評價 腸黏膜損傷程度參考Chiu評分法評分［3］:0分:正常黏膜;1分:絨毛頂端上皮下間隙增大;2分:上皮層和固有層中度分離;3分:絨毛兩側(cè)有大量分離伴有部分絨毛頂端破損;4分::絨毛破損伴有固有層毛細血管大量暴露;5分:固有層破壞、出血及潰瘍。每個動物觀察10個視野，評分總和為小腸病理評分。

1.4.4 腸黏膜MPO活性測定 參考Luis［4］采用比色法。試劑盒由南京建成生物有限公司提供，按說明書進行操作。取組織約100 mg，加入5%溴化十六烷基三甲胺(Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB，購自 Sigma 公司)溶液 2 ml，勻漿器勻漿，超聲粉碎亞細胞成分(50瓦10 s，共5次)，于4℃以12000 g離心20 min。取上清0.1 ml加0.167 g/L鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸化物(Sigma公司)及0.0005%過氧化氫混合液2.9 ml。保持溫度27℃，紫外分光光度計在460nm處記錄1 min內(nèi)吸光度的變化代表酶活力的改變。即用每分鐘△OD/g表達MPO活性(27℃)。

1.4.5 血漿TNF-α濃度和IL-10濃度 采用放免法檢測，試劑盒由上海放射免疫分析技術(shù)研究有限公司提供。取聚苯乙烯試管編號后加入標本血漿，加入分離劑后充分混勻，室溫放置20 min，4℃500 g離心25 min，吸棄上清液，在SN-682型放射免疫γ計數(shù)器(上海核福光電儀器有限公司)自動計數(shù)，分析程序直接給出有關(guān)技術(shù)參數(shù)、標準曲線及待測樣品濃度ng/ml。

1.4.6 血液主要電解質(zhì)和酸堿值 心尖部取血1 ml送檢血氣分析(M3562A，德國 Philips公司)，比較［K+］和［Ca2+］差異和酸堿失衡。

2 結(jié)果

2.1 腦皮層血管內(nèi)皮和周圍組織學(xué)改變 光鏡下HPO組再灌注后皮層神經(jīng)細胞較為稀疏，間質(zhì)水腫，見血管內(nèi)皮損傷，周圍組織有明顯空亮水腫。電鏡下:Sham組大致正常。核圓形核仁明顯，染色質(zhì)均勻。HPO組腦組織水腫，膠質(zhì)細胞變性。血管周圍神經(jīng)突起水腫，崩解;有少數(shù)變性線粒體。(見圖 1、2)。

2.2 BBB通透性和腦組織含水量變化 和Sham組比較，HPO組腦皮質(zhì)EB含量和組織含水量均明顯增高，分別為(13.11±1.5)ng/mg vs(4.99±0.6)ng/mg以及(82.1±1.9)%vs(78.1±1.2)%，(均P＜0.05)，提示BBB通透性增加(見圖4)。

2.3 腸黏膜損傷 和Sham組比較，HPO組小腸黏膜表面糜爛，炎癥滲出，PMN細胞聚集，可見血管內(nèi)皮損傷，Chiu'評分312±42(P＜0.01)。腸黏膜MPO活性:HPO組再灌注后腸MPO活性相對Sham組顯著增高(P＜0.01)。提示HPO再灌注后腸道組織PMN數(shù)量明顯增加。(見表1、圖3)

2.4 血漿細胞因子TNF-α和IL-10濃度的變化:與Sham組比較，單純HPO組TNF-α和IL-10濃度升高，其中TNF-α升高明顯，均數(shù)約為對照組2.75倍(P＜0.01)，IL-10升高約1.55倍(P＜0.05)。(見表1)

表1 兩組腸黏膜Chiu'評分、MPO活性、血清 TNF-α、IL-10和［K+］、［Ca2+］的比較(±s)

表1 兩組腸黏膜Chiu'評分、MPO活性、血清 TNF-α、IL-10和［K+］、［Ca2+］的比較(±s)

與Sham組比較，*P＜0.01，△P＜0.05

Group(n=8)腸黏膜Chiu'評分腸黏膜MPO活性(每分鐘ΔOD/g)TNF-α］IL-10(ng/ml)pH ［K+］［Ca2+(mmol/L)Sham 30±11 0.46±0.11 1.2±0.2 17.1±2.7 7.1±0.2 5.5±0.2 1.8±0.1 HPO 312±42* 0.99±0.25△ 3.3±0.1△ 26.5±4.4△6.9±0.1 7.2±1.9 1.1±0.2

2.5 主要電解質(zhì)和酸堿值 再灌注6 h后HPO組和Sham組pH值7.1±0.2和6.9±0.1;［K+］:7.2±1.9和5.5±0.2(mmol/L);［Ca2+］:1.1±0.2和 1.8±0.1(mmol/L)，(均P＜0.05)。(見表1)

圖1-2 光鏡和電鏡下兩組腦皮層組織和血管內(nèi)皮比較

圖3 光鏡下各組腸黏膜組織比較

圖4 各組腦皮層EB含量和組織含水率的比較

3 討論

HPO后再灌注損傷的病理生理改變比單一肝和腸的缺血再灌注損傷更為復(fù)雜。不但有肝臟IR損傷，而且阻斷門靜脈后腸道血液回流中斷、組織嚴重淤血，當循環(huán)阻力增加到一定程度后動脈血流將完全停止，可有出血和血栓形成，再灌注過程中產(chǎn)生淤血再灌注損傷，淤血組織血流恢復(fù)較缺血組織更緩慢和不完全，損傷較缺血性損傷更為嚴重［5］。這些病理生理基礎(chǔ)也是HPO圍術(shù)期所有病理改變的根源，在原位損害的基礎(chǔ)上還可傷及遠隔臟器。lexin等［6］發(fā)現(xiàn)阻斷肝門2 h再灌注后80%大鼠在48 h內(nèi)死亡，直接原因分別是肺損傷(30%)、心衰(26%)等，死于肝衰竭的僅20%。大腦由于血流和代謝特點可在遠程臟器再灌注損傷中受損［7］。實驗結(jié)果見HPO再灌注后腦皮層出現(xiàn)明顯的血管內(nèi)皮損傷，血管周圍組織水腫。BBB完整性的破壞是腦水腫等腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。伊文氏藍(EB)是經(jīng)典的BBB示蹤劑，正常情況下與白蛋白成復(fù)合物不能通過BBB，當BBB完整性破壞時可進入腦組織間隙，其滲出量與BBB的破壞程度成正相關(guān)，可反映BBB的損傷程度［8］。實驗結(jié)果提示HPO后出現(xiàn)腦皮層組織EB含量明顯升高，均值約為sham組的2.63倍，提示BBB明顯。同時也見腦組織含水率輕度增加，有腦水腫傾向。臨床肝移植中也見術(shù)后血清S100β蛋白升高，提示血腦屏障(BBB)通透性發(fā)生改變［2］，這種病理變化可能也是臨床病例出現(xiàn)術(shù)后認知功能障礙的原因之一。

本實驗條件下腦皮層和BBB本身沒有經(jīng)歷缺血再灌注過程，其損傷的來源是肝門阻斷再灌注后肝腸缺血/淤血再灌注的損傷。實驗結(jié)果見HPO后腸損傷嚴重，Chui'評分遠大于sham組。IR損傷致腸黏膜中中性粒細胞(PMN)被致炎因子激活而在組織內(nèi)聚集，脫顆粒、釋放溶酶體酶，其中彈性蛋白酶對血管和組織有較強的破壞性。過度的炎癥反應(yīng)又可引起PMN呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量的超氧陰離子和過氧化氫能導(dǎo)致組織細胞和血管內(nèi)皮細胞損傷［9］，在再灌注的后期對組織損傷有著明顯的放大作用，氧源性損害是重要原因之一［10］。PMN還能產(chǎn)生大量的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物如前列腺素、白三烯、PAF等傷害因子通過血液和循環(huán)系統(tǒng)傳遞到全身臟器，引起腦皮層等遠隔臟器的繼發(fā)損害。因此腸黏膜屏障損害一直被認為是機體全身炎性反應(yīng)(SIRS)的引擎。髓過氧化物酶(MPO)是PMN嗜天青顆粒中含量較高的酶，每個PMN中所含的MPO相對恒定，所以組織中MPO活性的高低基本上可定量表達組織中PMN的數(shù)量。實驗結(jié)果顯示雖然HPO模型中肝門僅阻斷30 min，但再灌注6 h后腸黏膜組織中即有MPO活性增加，和病理結(jié)果中組織PMN浸潤程度符合。Tetik等［11］的研究結(jié)果也與此一致。

腸道IR損傷后局部炎性細胞大量釋放的細胞因子是引起PMN激活和聚集的主要因素，許多研究已表明和粘附分子(Ams)、TNF-α、血小板活化因子(PAF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、緊密連接結(jié)構(gòu)(TJ)以及氧自由基等多種因素［11］有關(guān)。在這些細胞因子中TNF-α作用居首位，在受到致病因素作用后，它產(chǎn)生最快、到達高峰時間最早，并且能刺激其他幾種促炎因子如IL-1、IL-6、IL-8、PAF等的產(chǎn)生和釋放，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞活化、白細胞遷移、粒細胞脫顆粒及抑制纖溶反應(yīng)、增加微血管通透性、促進血栓形成等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，是SIRS形成的重要因素［10］。實驗結(jié)果中HPO組TNF-α升幅較大，均數(shù)為對照組的2.75倍，提示TNF-α在HPO后腸損傷中有重要作用。

TNF-α等促炎因子還能反饋引起內(nèi)源性抗炎介質(zhì)(如IL-10)的釋放，通過抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生促炎因子以達到制衡炎癥反應(yīng)的作用。當IR損傷嚴重引起大量炎癥介質(zhì)入血(瀑布樣釋放)，而內(nèi)源性抗炎介質(zhì)又不足以抵消其作用時，細胞因子由保護作用轉(zhuǎn)變?yōu)樽陨砥茐淖饔茫坏珦p傷腸道局部組織細胞，同時打擊遠隔器官，最終導(dǎo)致MODS的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示HPO組TNF-α升高明顯，但IL-10分泌量較小，不足以調(diào)節(jié)再灌注過程中細胞因子間的平衡，難以抑制PMN在腸道組織中的聚集和炎性因子的致炎傷害。實驗中還觀察到HPO再灌注后還能引起體循環(huán)內(nèi)高鉀血癥和酸血癥，酸堿失衡和所致的電解質(zhì)紊亂可能也是造成腦皮層血管內(nèi)皮損傷的原因之一。研究不足之處是未能將上述幾種可能原因分別單列，研究單一因素對腦血管內(nèi)皮的影響，這也將在進一步的深入研究中進行。

綜上所述，HPO后再灌注損傷比單一肝和腸的IR損傷更為復(fù)雜，腸淤血再灌注損傷嚴重，產(chǎn)生和釋放致炎因子經(jīng)過血液和循環(huán)傷及遠隔臟器，可致腦皮層BBB通透性增加，有腦水腫傾向。

［1］Zdeno Pirnik，Jana Bundzikova，Tomas Francisty，et al.Effect of liver ischemia-reperfusion injury on the activity of neurons in the rat brain.Cell Mol Neurobiol，2009，29(6-7):951-960.

［2］龍波，李妍，陳衛(wèi)民.肝移植患者血清中S-100β蛋白濃度變化及機制.世界華人消化雜志，2008，16(6):640-644.

［3］ChiL C J，AliceH，Mc，Mdle，et al.Intestinal mueosal lesion in low flow states.Arch Surg，1970，101(5):478.

［4］Luis H，Pereyra T，Shohachi S，et al.Neutrophils cytokines and adhe2 sion molecules in hepatic ischemia and reperfusion injury.J Am CollSurg，1994，179:758-762.

［5］朱春富，劉勝利，徐皓，等.大鼠小腸淤血再灌注損傷的實驗研究. 中國血液流變學(xué)雜志，2005，15(2):200-203，229.

［6］Lexin Liu，C-H Hakansson，B Jeppsson，et al.Extra-hepatic multiple organ damage following prolonged hepatic inflow interruption:A new experimental finding.Med Sci Res，1994，22:361-364.

［7］Kapinya KJ.Ischemic tolerance in the brain.Acta Physiol Hung，2005，92(1):67-92.

［8］Carrera RM，Pacheco AM Jr，Mastroti RA.Qualitative evaluation of the blood-brain barrier after the use of hypertonic saline solution in young rats.Eur Surg Res，2001，33(5-6):311.

［9］Gasche Y，Copin JC.Blood-brain barrier pathophysiology and ischaemic brain oedema.Ann Fr Anesth Reanim，2003，22(4):312-319.

［10］鄭曉春，陳彥青，吳曉丹，等.肢體缺血預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注所致心肌損傷的影響.中華麻醉學(xué)雜志，2008，28(7):654-657.

［11］Tetik C，Ozden A，Calli N，et al.Cytoprotective effect of trimetazidine on 60 minutes of intestinal ischemia reperfusion injury in rats.Transpl Int，1999，12:108-112.