黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系TYR、TYRP1的基因表達(dá)水平比較分析

趙彥斌，孫兆增，白杰英，張小飛，李愛(ài)學(xué)，柳巨雄，隋麗華，胡仲明，曾 林

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系TYR、TYRP1的基因表達(dá)水平比較分析

趙彥斌1，孫兆增1，白杰英1，張小飛1，李愛(ài)學(xué)1，柳巨雄2，隋麗華1，胡仲明1，曾 林1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

目的 本研究旨在研究TYR、TYRP1基因在黑線倉(cāng)鼠與白化突變系皮膚組織中的表達(dá)情況，探索其與白化毛色性狀的產(chǎn)生是否具有相關(guān)性。方法 以黑線倉(cāng)鼠和白化突變系皮膚組織為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)，分別得到黑線倉(cāng)鼠與白化突變系TYR和TYRP1基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 黑線倉(cāng)鼠皮膚中的TYR和TYRP1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別是白化突變系皮膚組織中的2.5倍和5.3倍。結(jié)論 表明黑線倉(cāng)鼠皮膚中TYR、TYRP1的基因表達(dá)水平存在表達(dá)差異，白化突變系 TYR、TYRP1基因發(fā)生表達(dá)下調(diào)，揭示出了 TYR、TYRP1基因的表達(dá)量與白化突變系白化性狀的產(chǎn)生有關(guān)。

白化突變系;TYR;TYRP1;實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

毛發(fā)與皮膚中黑色素的數(shù)目、種類與分布的差異使哺乳動(dòng)物產(chǎn)生不同的毛色［1］。酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrosinase related protein，TYRP1)都屬于黑色素細(xì)胞家族的成員，調(diào)控黑色素的合成過(guò)程。酪氨酸酶(TYR)對(duì)哺乳動(dòng)物各種不同毛色的產(chǎn)生至關(guān)重要，因此 TYR基因也往往成為研究動(dòng)物不同毛色表型的熱點(diǎn)基因［2－3］。人、小鼠、大鼠等物種的酪氨酸酶基因位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和功能已得到深入的研究，TYR是黑色素形成的關(guān)鍵酶也是限速酶之一，它的表達(dá)活性決定著黑色素合成的數(shù)目及速度，小鼠TYR基因被定位在白化位點(diǎn)上，它的突變往往會(huì)導(dǎo)致黑色素的合成受阻，因此該基因的克隆多被用于研究白化病等色素缺失性疾?。?］。TYRP1基因是首先被克隆得到的一種色素基因，TYRP1基因編碼二羥基吲哚羧酸氧化酶，在黑色素合成的下游途徑發(fā)揮作用，它定位于小鼠的brown位點(diǎn)。了解這些調(diào)控黑色素生成相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)規(guī)律，有助于闡明色素形成的機(jī)制。近些年已有研究者進(jìn)行過(guò)TYR、TYRP1基因突變與不同毛色產(chǎn)生的關(guān)系的研究［5－6］，但是關(guān)于不同毛色表型的產(chǎn)生與TYR、TYRP1表達(dá)量變化是否具有相關(guān)性的研究報(bào)道較為匱乏。

黑線倉(cāng)鼠白化突變系是培育形成的一種新實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系，但目前對(duì)其白化性狀產(chǎn)生的機(jī)制還缺乏深入的研究，鑒于 TYR、TYRP1在黑色素合成中的重要作用，本研究將對(duì) TYR、TYRP1基因的研究作為明確黑線倉(cāng)鼠產(chǎn)生白化性狀原因的出發(fā)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(QRT－PCR)首次研究TYR、TYRP1在黑線倉(cāng)鼠與其白化突變系皮膚組織中mRNA的表達(dá)量，比較其表達(dá)量的差異，以明確TYR、TYRP1的基因表達(dá)量與白化性狀產(chǎn)生的相關(guān)性，為最終揭示黑線倉(cāng)鼠白化突變系白化性狀的產(chǎn)生機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系，體重20～22 g，雌雄各8只，8周齡。購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK－(軍)2007－004］，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào):［SYXK－(軍)2007－005］。

1.2 儀器和材料

Trizol(Invitrogen);DEPC(Promega);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)、SYBR Premix Ex TaqTMII、pMD18－T 載體購(gòu)自TaKaRa公司;DNA Marker2000(康為世紀(jì));凝膠回收試劑盒(BioFlux);Real Time PCR 擴(kuò)增儀 (BIO－RAD iQTM5).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取及 RT－PCR:

使用 Trizol一步法提取黑線倉(cāng)鼠與白化突變系皮膚組織總 RNA，電泳檢測(cè)其完整性，并使用ND2100微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定核酸濃度和純度。

將各皮膚樣本總RNA稀釋為相同的濃度，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:5× PrimeScriptTMBuffer 4 μL，PimeScript RT Enzyme Mix 1.0 μL，Oligo(dT)Primer1.0 μL，隨機(jī)引物 1.0 μL ，Total RNA 2 μL，DEPC 水加至20 μL。反應(yīng)條件:37℃ 30 min，85℃7 s;4℃保存。以特異引物進(jìn)行目的基因 PCR擴(kuò)增，克隆后測(cè)序鑒定。

1.3.2 合成引物:

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)已克隆測(cè)序得到的黑線倉(cāng)鼠TYR與TYRP1序列設(shè)計(jì)引物，并且通過(guò)Blast初步檢測(cè)引物的特異性。TYR基因上下游引物序列分別 為:5＇－GTAAGTTTGGATTTGGGGG－3＇和5＇－ATATGTGCCTGTGGGGATG－3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為204 bp;TYRP1基因上下游引物序列分別為:5＇－CAGGTTTGGGCTCAGTTTCC－3＇和 5＇－CGGTCATC TTTACCATCGTG－3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 190 bp;內(nèi)參基因β－actin上下游引物序列 分 別 為:5＇－AGTGTCCCAACATCCCAGC－3＇和 5＇－GTGACACCGT CCCCAGAAT－3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 194 bp。

1.3.3 QRT－PCR:

標(biāo)準(zhǔn)曲線:以黑線倉(cāng)鼠與白化突變系皮膚組織的cDNA為模板，按照3倍梯度稀釋5個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行QRT－PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，上、下游引物各 0.6 μL，cDNA 模板2 μL，滅菌蒸餾水加至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 30 s;變性 95℃ 5 s，退火 55℃ /61℃/60℃(β－actin/TYR/TYRP1)20s，循環(huán) 40 次;熔解曲線為95℃ 1 min;55℃ 1 min;55℃循環(huán)133次(每隔0.3℃采集一次熒光信號(hào))，直到94.6℃。反應(yīng)結(jié)果使用儀器自身攜帶的軟件收集、分析。所有的樣品都在同一塊板中做3次重復(fù)，數(shù)值以x±s表示。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析:

通過(guò)儀器自帶的軟件導(dǎo)出目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、擴(kuò)增效率以及直線方程系數(shù)(斜率)，并分析兩者斜率之差。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的鑒定

皮膚總RNA用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，28S、18S條帶清晰可見(jiàn)(圖略)，說(shuō)明RNA無(wú)明顯降解;RNA樣品的OD260/OD280均在1.8～2.0之間，所提RNA符合要求.

2.2 擴(kuò)增效率分析

內(nèi)參基因、TYR、TYRP1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線建立后，分別得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，其相關(guān)系數(shù)之差 ＜0.1，表明β－actin分別與 TYR、TRP1基因擴(kuò)增反應(yīng)效率基本一致，本實(shí)驗(yàn)可采用2－ΔΔT相對(duì)定量方法。其中ΔCT目的基因 =CT目的基因－CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT黑線倉(cāng)鼠－ΔCT白化突變系，TYR、TYRP1 mRNA 表達(dá)差別倍數(shù)以2－ΔΔT表示。

2.3 QRT-PCR結(jié)果

熒光定量的擴(kuò)增曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的S形擴(kuò)增曲線(圖1)，TYR、TYRP1基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線整體無(wú)明顯上揚(yáng)趨勢(shì)現(xiàn)象、平行性較好，曲線拐點(diǎn)清楚。

TYR、TYRP1基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線上只有1個(gè)明顯的峰(圖2)，表明內(nèi)參基因、TYR及TYRP1基因沒(méi)有非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的產(chǎn)生。

2.4 TYR、TYRP1基因在黑線倉(cāng)鼠與白化突變系的表達(dá)量比較分析

采用2－ΔΔT相對(duì)定量方法分析表達(dá)量，TYR基因在黑線倉(cāng)鼠皮膚組織中的mRNA表達(dá)量是白化突變系的2.5倍;TYRP1基因在黑線倉(cāng)鼠皮膚組織中 mRNA表達(dá)水平是白化突變系的5.3倍 (圖3)。

圖1 TYR、TYRP1、β－actin基因的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 PCR amplification plots for TYR、TYRP1、β－actin

圖2 TYR、TYRP1與 β －actin基因的溶解曲線Fig.2 Dissociation curve for TYR、TYRP1、β－actin gene

圖3 TYR TYRP1基因的相對(duì)定量結(jié)果Fig.3 Relative quantification results of TYR、TYRP1 gene

3 討論

酪氨酸酶(TYR)對(duì)黑色素合成過(guò)程至關(guān)重要，TYR是黑色素形成的關(guān)鍵酶也是限速酶之一，酪氨酸經(jīng)該酶催化氧化為各種衍生物，而黑色素正是這些衍生物的聚合物。目前資料中已報(bào)道的小鼠白化性狀產(chǎn)生的原因大多與TYR基因的突變有關(guān)，因此編碼酪氨酸酶的TYR基因也就成了研究動(dòng)物白化性狀和人的白化病的熱點(diǎn)候選基因。研究發(fā)現(xiàn)TYR的基因表達(dá)量在非色素沉著性毛發(fā)中明顯低于色素沉著性毛發(fā)［7］。而本研究結(jié)果顯示 TYR基因在黑線倉(cāng)鼠中的 mRNA表達(dá)量是白化突變系的2.5倍，結(jié)果揭示白化突變系 TYR基因表達(dá)量的降低，促使黑色素細(xì)胞合成與沉積的黑色素減少，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)生了白化毛色表型。

酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP1)在黑色素合成的下游調(diào)控過(guò)程中起重要作用。TYRP1是黑色素細(xì)胞特異性家族成員，由 brown位點(diǎn)基因編碼，TYRP1基因的表達(dá)情況使毛發(fā)與皮膚產(chǎn)生不同顏色［8］。本研究結(jié)果表明 TYRP1 mRNA表達(dá)量在黑線倉(cāng)鼠皮膚組織中是白化突變系的5.3倍，TYRP1基因在黑線倉(cāng)鼠皮膚組織中的表達(dá)水平要明顯高于白化突變系，結(jié)論提示黑線倉(cāng)鼠 TYRP1的基因表達(dá)量與白化毛色表型的出現(xiàn)具有一定的相關(guān)性，認(rèn)為這可能與TYRP1的表達(dá)調(diào)控序列有關(guān)，其可以調(diào)控該基因的表達(dá)量。

本研究發(fā)現(xiàn)了黑線倉(cāng)鼠白化表型與 TYR、TYRP1的基因表達(dá)量有一定的相關(guān)性。TYR、TYRP1在黑線倉(cāng)鼠中的表達(dá)量要高于白化突變系，提示TYR、TYRP1都在色素沉著過(guò)程中起到了調(diào)控作用。本研究為闡明TYR、TYRP1基因?qū)谏匦誀畹恼{(diào)控機(jī)制，以及黑線倉(cāng)鼠白化突變系白化性狀產(chǎn)生機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

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Comparison of Gene Expression Levels of TYR、TYRP1 Gene in Cricetulus barabensis and the Albino mutant

ZHAO Yan－bin1，SUN Zhao－zeng1，BAI Jie－ying1，ZHANG Xiao－fei1，LI Ai－xue1，LIU Ju－xiong2，SUI Li－h(huán)ua1，HU Zhong－ming1，ZENG Lin1
(1.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China)

Objective To explore the relationship between gene expression of Cricetulus barabensis TYR gene family and Cricetulus barabensis coat color.Methods The relative expression quantity of TYR，TYRP1 in Cricetulus barabensis of different colors was analyzed by using real time quantitative PCR in this research.Results The relative expression quantity of TYR，TYRP1 in Cricetulus barabensis respectively were 2.5，5.3 times than that in the Albino mutant，all results were corrected by the household gene.Conclusion The findings indicated that gene expression level of TYR gene family in Cricetulus barabensis were higher than that in the Albino mutant，and the gene expression level of TYR gene family were related with phenotype of Cricetulus barabensis coat color.

Albino mutant;Cricetulus barabensis;TYR;TYRP1;Real time quantitative PCR

Q95－331 R332

A

1671－7856(2012)07－0001－04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.001

2012－07－05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30870347);十二五重大專項(xiàng)“高致病病源動(dòng)物模型研究(2012ZX10004502)。

趙彥斌(1984－)，男，博士生，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。

曾林(1965－)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，E－mail:zenglin1965@126.com。