Ⅰ型牛皰疹病毒TK－/gE－基因雙缺失突變株生物學(xué)特性

定 明，范 強(qiáng)，時(shí)彥勝，張小飛，張廣州，李 春，白杰英，劉正飛

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070;3.解放軍第208醫(yī)院，長(zhǎng)春 130062)

Ⅰ型牛皰疹病毒TK－/gE－基因雙缺失突變株生物學(xué)特性

定 明1，2，范 強(qiáng)2，時(shí)彥勝1，張小飛1，張廣州1，李 春3，白杰英1，劉正飛2

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070;3.解放軍第208醫(yī)院，長(zhǎng)春 130062)

目的 構(gòu)建Ⅰ型牛皰疹病毒(BHV-1)的TK－/gE－雙缺失突變株，檢測(cè)其生物學(xué)功能，為治療牛傳染性鼻氣管炎提供參考。方法 構(gòu)建了帶有EGFP表達(dá)盒的BHV-1 TK－/gE－雙缺失突變株。通過southern雜交、蛋白質(zhì)斑點(diǎn)印跡、空斑試驗(yàn)、MDBK細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等技術(shù)方法，對(duì)重組基因所構(gòu)成病毒突變株的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果 Southern雜交及蛋白斑點(diǎn)印跡表明，課題組成功構(gòu)建了帶有EGFP表達(dá)盒的雙缺失突變株;該突變株具有與野生株相當(dāng)?shù)姆敝沉Γ玊K－/gE－成功缺失，毒力大幅減弱;BHV-1 TK－/gE－遺傳穩(wěn)定，不會(huì)返強(qiáng)。結(jié)論 本項(xiàng)目組成功構(gòu)建了Ⅰ型牛皰疹病毒(BHV－1)的TK－/gE－雙缺失突變株，該缺失株具有良好的安全性和穩(wěn)定性，為該突變株進(jìn)一步作為生物安全疫苗和多價(jià)病毒載體提供了依據(jù)，為預(yù)防和治療牛傳染性鼻氣管炎提供了技術(shù)支持。

牛皰疹病毒;TK－/gE－突變株;生物學(xué)特性

牛傳染性鼻氣管炎(InfectiousBovine Rhinotracheitis，IBR)是由Ⅰ型牛皰疹病毒(BHV-1)引起的一種牛的接觸性傳染病，被OIE列為B類疾病，其爆發(fā)和流行給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。許多國(guó)家都制定了根除計(jì)劃，其中英國(guó)、丹麥等國(guó)采用的是撲殺措施;捷克和斯洛文尼亞用gE基因缺失疫苗和鑒別診斷方法相結(jié)合，而美國(guó)主要是使用TK基因缺失疫苗對(duì)其加以控制［5］。

我國(guó)自20世紀(jì)80年代首次從新西蘭進(jìn)口奶牛群中分離到病毒［8］，當(dāng)前已有多個(gè)省市的抽樣調(diào)查中發(fā)現(xiàn)該病毒。據(jù)近年相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)牛群陽(yáng)性感染率逐年上升，部分地區(qū)甚至達(dá)到67%以上，因此，制定我國(guó)的牛傳染性鼻氣管炎根除計(jì)劃勢(shì)在必行。目前我國(guó)還未研制出具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因缺失疫苗，為了適應(yīng)我國(guó)市場(chǎng)的需要和我國(guó)加入WTO后的國(guó)際形勢(shì)，我們構(gòu)建了同時(shí)缺失TK、gE基因的雙缺失突變株。本研究通過對(duì)該雙缺失突變株的生物學(xué)特性作進(jìn)一步地研究，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為其作為更加安全的病毒載體奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒和細(xì)胞。BHV-1野生株由本課題組分離，BHV-1 TK－/gE－/EGFP+由本課題組構(gòu)建，牛腎傳代細(xì)胞MDBK購(gòu)自上海中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，DNA回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，地高辛標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒購(gòu)自GibcoBRL公司，gE單克隆抗體由本課題組制備，羊抗鼠HRP-IgG為二抗購(gòu)自SBA公司。

1.3 TK寡核苷酸探針的制備。以 BHV-1 TK－/EGFP+基因組 DNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出一段TK與EGFP的連接處，約300 bp的 DNA片段，用DNA回歸試劑盒回收后，用地高辛標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒標(biāo)記，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 參照文獻(xiàn)［6］中方法進(jìn)行 southern雜交和蛋白質(zhì)斑點(diǎn)印跡。

1.5 空斑試驗(yàn)。將BHV-1 TK－與BHV-1分別接毒于長(zhǎng)滿MDBK細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行空斑試驗(yàn)，比較兩者在48 h空斑大小［7］。

1.6 病毒組織培養(yǎng)半數(shù)感染致死量(TCID50)的測(cè)定按Reed-muench兩氏法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 BHV-1 TK－/EGFP+的Southern雜交鑒定

以BHV-1 TK－/EGFP+基因組 DNA為模板，擴(kuò)增出長(zhǎng)為303 bp的DNA片斷作為探針，其序列如圖1，將 BHV-1與 BHV-1 TK－/EGFP+基因組 DNA分別用SphⅠ酶切，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交。結(jié)果顯示 BHV-1 TK－/EGFP+DNA經(jīng)酶切后雜交條帶約4.8 kb(其中含有1932 bp的EGFP表達(dá)盒)，而BHV-1 DNA酶切后雜交條帶約3.5 kb，圖2所示，測(cè)序結(jié)果證實(shí)TK基因已經(jīng)缺失，缺失大小為632 bp。

圖1 TK探針核苷酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of TK probe

2.2 蛋白質(zhì)斑點(diǎn)印跡鑒定

接種BHV-1 TK－/gE－/EGFP+和BHV-1于鋪滿單層的MDBK細(xì)胞，待出現(xiàn)較多的CPE和有層狀脫落時(shí)收獲。在－20℃中凍融3次，取凍融液3μL滴于硝酸纖維膜膜上，風(fēng)干后重復(fù)滴加2次。以鼠抗gE單克隆抗體為一抗，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色，結(jié)果如圖3。BHV-1打點(diǎn)后顯出深褐色，為陽(yáng)性;而BHV-1 TK－/gE－/EGFP+及MDBK細(xì)胞對(duì)照為陰性。這表明gE基因刪除后，BHV-1 TK－/gE－/EGFP+不能表達(dá) gE糖蛋白。

圖2 BHV-1 TK－/EGFP+的southern雜交鑒定Fig.2 Identification of BHV-1 TK－/EGFP+bysouthern hybridization

圖3 TK－/gE－/EGFP+的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)印跡Fig.3 Identification of BHV－1 TK－/gE－/EGFP+by western blot

2.3 空斑大小比較

按 Kolmogorov Smirnov法［1］測(cè)定比較，并通過 t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:BHV-1 TK－空斑大小為0.42mm～0.72mm;而野生株 BHV-1空斑為0.52mm～1.06mm，缺失突變株形成的空斑明顯小于野生株。這表明，TK的缺失可能影響了BHV-1在細(xì)胞上的增殖后擴(kuò)散能力，這與文獻(xiàn)［4］TK功能缺失的毒株，毒力大幅下降，而且其在神經(jīng)細(xì)胞等非分裂細(xì)胞中只有很低的增殖擴(kuò)散能力的結(jié)論相符。

2.4 BHV-1 TK－/gE－/EGFP+的增殖特性

測(cè)定BHV-1 TK－/gE－/EGFP+傳代細(xì)胞凍融液毒價(jià)，結(jié)果為 10－6.4/0.1mL(1.92×106PFU)。以100 μL、10 μL、1 μL、0.1 μL、0.01 μL、0.001 μL 分別接種于長(zhǎng)滿MDBK細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待出現(xiàn)CPE后收獲上清，分別測(cè)定毒價(jià)，結(jié)果如表1、圖4。結(jié)果顯示，取原液 1 μL或 0.1 μL毒價(jià)較高，其說明在TK、gE基因雙缺失后，突變株仍能在細(xì)胞培養(yǎng)物上增殖，且增殖能力并未大幅度丟失。

表1 接種不同體積病毒原液后的毒價(jià)變化Tab.1 Variation of virus titer with different volume of BHV-1 TK－/gE－/EGFP+

圖4 接種不同體積病毒原液后的毒價(jià)變化Fig.4 Variation of virus titer with different volume of BHV-1 TK－/gE－/EGFP+

取BHV-1 TK－/gE－/EGFP+傳代細(xì)胞凍融液1 μL接種于細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每隔8 h收獲毒一次，分別測(cè)定毒價(jià)，結(jié)果如表2:

表2 接種病毒后不同時(shí)間的毒價(jià)變化Tab.2 Variation of of BHV-1 TK－/gE－/EGFP+titer in different time

圖5 接種病毒后不同時(shí)間的毒價(jià)變化Fig.5 Variation of BHV-1 TK－/gE－/EGFP+titer in different time

由上表可見，隨著時(shí)間的推移BHV-1的毒價(jià)呈先升高，而后又逐漸下降。-lgTCID50/0.1mL高于6.0的時(shí)間可維持40 h以上。

而生長(zhǎng)曲線顯示，BHV-1 TK－/gE－/EGFP+能在MDBK細(xì)胞上增殖良好。不同時(shí)相比較毒價(jià)時(shí)，以48 h增殖滴度最高。結(jié)果如圖5:

2.5 BHV-1 TK－/gE－/EGFP+的遺傳穩(wěn)定性

圖6 BHV-1 TK－/gE－/EGFP+的遺傳穩(wěn)定性Fig.6 The heredity stability of BHV-1 TK－/gE－/EGFP+

將BHV-1 TK－/gE－/EGFP+在MDBK細(xì)胞上連續(xù)接種9代，用PCR鑒定，結(jié)果均能擴(kuò)出缺失gE基因后剩余的約500 bp大小的條帶，如圖6。表明BHV-1 TK－/gE－/EGFP+在MDBK細(xì)胞上穩(wěn)定遺傳而不發(fā)生返強(qiáng)。

3 討論

通過Southern雜交和蛋白質(zhì)斑點(diǎn)印跡鑒定試驗(yàn)表明TK基因完全缺失，而gE基因在缺失絕大部分1731 bp后，突變株不能產(chǎn)生gE糖蛋白，這為BHV-1 TK－/gE－/EGFP+的臨床應(yīng)用提供了一個(gè)鑒別標(biāo)志，也就是說，牛在注射該基因缺失疫苗病毒后，血液中不產(chǎn)生針對(duì) gE的抗體，結(jié)合 gE鑒別 ELSA方法即可將疫苗免疫牛和野毒感染牛相區(qū)分，從而淘汰野毒感染牛，建立健康牛群，因此 BHV-1 TK－/gE－/EGFP+是一株血清學(xué)“標(biāo)志”疫苗［2］。

胸苷激酶基因TK和糖蛋白基因gE均是牛傳染性鼻氣管炎病毒重要的毒力基因，二者缺失后，牛傳染性鼻氣管炎病毒仍能在細(xì)胞培養(yǎng)物上增殖，但由于gE基因與病毒在培養(yǎng)細(xì)胞之間的擴(kuò)散有關(guān)，因此缺失 gE后，病毒的滴度相對(duì)于野毒下降了。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3］，BHV-1在 MDBK上的增殖滴度可以達(dá)到10－7.5TCID50/0.1mL，而 TK/gE缺失后的突變株很難達(dá)到10－7.0TCID50/0.1mL。gE基因的缺失，不僅導(dǎo)致了牛傳染性鼻氣管炎病毒增殖能力下降，也影響到該病毒的其它生物學(xué)特性。

基因缺失疫苗的遺傳穩(wěn)定性也是疫苗研究的重要內(nèi)容，將 BHV-1 TK－/gE－/EGFP+在 MDBK細(xì)胞連續(xù)傳代，收毒后擴(kuò)增gE－約500 bp的片斷。結(jié)果表明傳至9代以上仍只能擴(kuò)出 gE缺失后的500bp基因片斷，不能擴(kuò)增出原基因gE的片斷。生產(chǎn)中的疫苗一般不能超過5代，因此 BHV-1 TK－/gE－/EGFP+突變株可以滿足生產(chǎn)疫苗的要求。本研究為該突變株的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，并為其進(jìn)一步作為生物安全疫苗及多價(jià)病毒載體奠定理論基礎(chǔ)。

［1］Graham，F(xiàn).L.and Van der Eb［J］.A.J.Virology ，1973，52:456.

［2］Hutchings DL.Lymphocyte proliferative responses to separated bovine herpesvirus 1 proteins in immune cattle［J］.J Virol，1990，64:5114－5122.

［3］Kaashoek M.J.Early immunity induced by a live gE-negative bovine herpesvirus 1 marker vaccine［J］.J.Vet.Microbiol，1996，53:20－26.

［4］Smith GA.Development and trial of a bovine herpesvirus 1－thymidine kinase deletion virus as a vaccine［J］.Aust Vet J，1994;71:65－70.

［5］李繼昌，于少軍，等.牛傳染性鼻氣管炎病的研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002，4:50.

［6］薩姆布魯克(美)，E.F.弗里奇，T曼尼阿蒂斯著。金冬雁，黎孟楓等譯。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)［M/T］.科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

［7］殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)(第二版)［M］.北京:科學(xué)出版社，1997.

［8］周泰沖，葉章明，等.從新西蘭進(jìn)口奶牛中分離傳染性牛鼻道氣管炎病毒［J］.獸醫(yī)科技雜志，1981:8－11.

Study on the Characteristics of BHV-1 TK－/gE－/EGFP+Gene-deleted Mutant Virus Strain

DING Ming1，2，F(xiàn)AN Qiang2，SHI Yan-sheng1，ZHANG Xiao-fei1，ZHANG Guang-zhou1，LI Chun3，BAI Jiey-ying1，LIU Zheng-fei2
(1.Laboratory Animal Center of Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China;2.Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;3.The 208thhospital of PLA，Changchun 130062，China)

Objective To detect the function of I BHV-1 TK－/gE－/EGFP+gene-deleted mutant virus strain，find a new method to prevent infectious bovine rhinotracheitis(IBR)，the charaction of TK－/gE－/EGFP+gene-deleted mutant virus strain was further studied.Methods Southern hybridization，western dot blot and Plaques test were employed in this investment.Results TK gene is deleted and the mutant cannot produce glycoprotein E when gE gene is deleted.The diameter of mutant strain much smaller than that of field strain，the mutant strain grows on MDBK cells and the virus titer can keep 106.0TCID50/0.1mL for more than 40 hours，which indicated that the mutant strain inherit instantly.Conclusion The gene-deleted mutant virus strain was successful constructed in this study，and the mutantvirus strain was stable.This will be useful for the further study of IBR.

Bovine hebetes virus;TK－/gE－gene-deleted mutant virus strain;Biological characteristic

R332

A

1671-7856(2012)07-0005-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.002

2012-07-05

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(200803018)。

定明，男，(1986－)，研究實(shí)習(xí)員，主要從事人獸共患傳染病研究。E-mail:raydming@yahoo.com.cn。

白杰英(1977－)，男，副研究員，主要從事人獸共患傳染病病原學(xué)研究。E-mail:baijieying@126.com;劉正飛(1973－)，男，教授。主要從事動(dòng)物病原微生物致病機(jī)制的研究。E-mail:lzf6789@mail.hzau.edu.cn。