競爭酶聯(lián)免疫法測定食品中雞蛋過敏原

張世偉 賴心田 洪曉明 王珍妮 李銳 楊國武

(深圳市計量質量檢測研究院 廣東深圳 518000)

1 前言

食品過敏是人們對食品產(chǎn)生的一種變態(tài)反應，在臨床上表現(xiàn)為蕁麻疹、哮喘、腹痛和腹瀉等多種癥狀，嚴重的可導致休克［1］。據(jù)統(tǒng)計全世界有0.5% －2.5%的兒童對雞蛋過敏，其中雞蛋導致的食物過敏發(fā)生率位居第二［2］。加工蛋制品仍然具有致敏性，有文獻證實，蛋類過敏原分別經(jīng)糖基化處理、6mol/L尿素處理、95℃加熱處理后仍不能完全脫敏［3］。目前，對雞蛋過敏原的檢測普遍采用以雞蛋中的主要致敏蛋白——卵白蛋白為檢測對象建立的雙抗夾心ELISA法。但在檢測工作中，筆者發(fā)現(xiàn)，雙抗夾心ELISA不能準確識別熱處理的蛋制品，檢測高溫烘焙或煎炸的含蛋制品容易發(fā)生假陰性。據(jù)報道，主要原因在于目標蛋白在加熱過程中發(fā)生了降解，導致雙抗夾心ELISA中的兩個抗體無法同時結合抗原［4］。而競爭ELISA中需要使用一個抗體，無論抗原是否發(fā)生了變性和降解，只要和抗體對應的抗原決定簇不發(fā)生變化，就能被抗體所識別，很好的克服了雙抗夾心ELISA的缺點。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

酪蛋白、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(DMF)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶、卵白蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、麥醇溶蛋白、大豆球蛋白購于Sigma公司;醛基活化的辣根過氧化物酶、脫鹽離心柱購于Thermo公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純;BALB/c小鼠A購自中山大學醫(yī)學院動物中心;ELISA反應檢測用試液配制參考文獻［5］。

2.1.2 儀器

超聲破碎儀為Uibracell VCX750購于Sonics and Materials公司，酶標儀為ELX808購于Biotek公司以及高速離心機、精密電子天平等常規(guī)儀。

2.2 方法

2.2.1 抗體的制備

將沸水浴處理30min的1mg/mL的卵白蛋白溶液免疫BALB/c小鼠，每只劑量0.1mL。單克隆抗體制備方法參考冷泉港實驗室手冊的方法進行［6］，使用硫酸銨沉淀法純化抗體［7］。

2.2.2 酶標抗體的制備

使用辣根過氧化物酶分別標記抗體。將0.3mg純化的抗體溶解于0.1mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液中。加入0.1mL 10mg/mL的活化醛基的辣根過氧化物酶溶液后4°C反應過夜。加入 30μL 0.2 mol/L的賴氨酸終止反應，透析純化后備用。

2.2.3 競爭ELISA操作

每孔加卵白蛋白100μL 4℃孵育過夜。第2天倒掉包被液，用洗滌液洗一遍，每孔再加200μL封閉液，37℃孵育3 h，倒掉封閉液。每孔加50μL酶標單克隆抗體和50μL樣品(或為卵白蛋白標準溶液以及沸水浴處理30min的卵白蛋白標準溶液)，陰性對照孔用 PBS代替。37℃反應0.5h，完后用PBST洗3次。加底物液，37℃反應10 min，H2SO4終止反應后上酶標儀讀數(shù)。以卵白蛋白濃度為橫坐標，B/B0為縱坐標繪制標準曲線(B為樣品或標準品的吸光度值，B0為空白溶液的吸光度值)。使用Origin 7.5四參數(shù)擬合計算標準曲線的IC50。同時，采用棋盤法試驗優(yōu)化包被抗原和酶標抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

2.2.4 ELISA 檢測抗體特異性

采用其他食品中常見的蛋白作考察對象，采用競爭ELISA檢測抗體與其之間的交叉反應。

2.2.5 檢測食品樣品的前處理

采用含0.5%二硫蘇糖醇的7M尿素作為樣抽提液體提取其中的蛋白成分。稱取5g均質食品樣品，使用樣品提取液定容至 100mL。超聲提取10min后離心，取0.5mL上清液使用脫鹽離心柱脫鹽后用于ELISA分析。

2.2.6 添加回收率的測定

將0.02g卵白蛋白溶于100mL含有1%NaHCO3的蒸餾水后再加入至100g面粉中，攪拌均勻，模擬烘烤產(chǎn)品制作工藝160℃烘烤30min，以及煎炸產(chǎn)品制作工藝250℃烘烤15min，與未熱處理前的樣品做對照，計算添加回收率和RSD。

3 結果與分析

3.1 ELSIA對熱處理卵白蛋白的識別

分別做出熱處理和未經(jīng)熱處理的卵白蛋白標準溶液的ELISA標準曲線，通過計算曲線的IC50進行比較。由圖1可知，熱處理后的卵白蛋白和抗體的結合力不但未降低，反而有所提高。這可能在于熱處理后蛋白的二級結構被破壞，使得與該抗體結合的抗原決定簇更好的暴露。熱處理和非熱處理卵白蛋白標準曲線的IC50分別為11.8μg/mL和14.9μg/mL。所以，本研究建立的檢測方法對長時間熱加工的蛋制品仍然適用。由于食品中的卵白蛋白均經(jīng)過熱處理過程，所以本方法采用熱處理30min后的卵白蛋白溶液作為方法的標準溶液，線性范圍為0.8 －80μg/mL(R2＞0.99)。

圖1 卵白蛋白競爭ELISA標準曲線

3.2 抗體的交叉反應

采用ELISA方法評估抗體對幾種食品中常見蛋白和干擾物的交叉反應。由表1可知，該方法特異性良好，對食品幾種常見的蛋白、干擾物無交叉反應，不易出現(xiàn)結果誤判。

表1 與各蛋白的交叉反應率

3.3 方法的檢出限和添加回收率

以陰性面制品(饅頭以及未添加卵白蛋白的模擬烘烤產(chǎn)品)的測定值加3倍標準差計算樣品的最低檢出限計算出本方法檢測食品中卵白蛋白的檢出限為20μg/mL。對模擬蛋制品的添加回收結果見表 2，未經(jīng)加熱，160℃ 烘烤 30min，230℃ 烘烤10min的產(chǎn)品添加回收率分別為94.3%，53.2%， 41.1%，RSD＜15%。

表2 不同熱加工樣品的添加回收率(n=6)

3.4 ELISA法測定市售樣品中卵白蛋白含量

對4個標識有雞蛋成分的陽性樣品和4個陰性樣品進行卵白蛋白的定量檢測。如表3所示，檢測結果和標簽標注的情況相符。6個平行樣的相對標準偏差RSD＜10%，說明該方法檢測實際樣品穩(wěn)定可靠，牛奶、豬肉、醬油、葡萄酒中的色素，脂肪，鹽分，雜蛋白等均不會對本方法形成干擾。

表3 樣品中卵白蛋白含量(n=6)

4 討論

食品中過敏原種類多樣，即使是蛋、奶這類成分較為簡單的食品原料也含有多個致敏蛋白。目前，過敏原的檢測往往選取食品原料中熱穩(wěn)定且高含量的致敏蛋白作為檢測對象。但Fu發(fā)現(xiàn)雞蛋中的致敏蛋白熱穩(wěn)定性普遍不理想。其比較了3個品牌的商品化試劑盒，無論采用卵白蛋白還是卵粘蛋白作為目標檢測物，傳統(tǒng)的雙抗夾心ELISA都無法對熱處理后的蛋白做出準確的識別。全蛋粉樣品經(jīng)232℃處理10 min后，最高的回收率也只能達到1%。而本研究建立的競爭ELISA，通過細胞篩選，得到針對熱穩(wěn)定抗原決定簇的抗體，該決定簇不會隨蛋白的變性或降解發(fā)生改變。由于競爭ELISA只需要一種抗體參與反應，反應時間比雙抗夾心ELISA更短，操作也更為簡便。沸水浴處理30min的卵白蛋白競爭標準曲線未發(fā)生明顯的改變。為了更真實的反應卵白蛋白在實際樣品熱加工過程中的變化，本研究通過將卵白蛋白加入至食品原料中再進行模擬加工的方法進行添加回收率實驗。230℃熱處理10min的面制品樣品的回收率為41%，大大高于Fu用商品化試劑盒報道的回收率［4］。理論上，由于熱處理對本研究建立的競爭ELISA的影響并不大，熱處理對回收率不應該有明顯的下降。但實際上熱烘焙的過程讓面粉中的蛋白發(fā)生變性，淀粉發(fā)生糊化、老化、脫水等變化，使目標蛋白的提取更加困難，導致了回收率的下降。

食品過敏原不同于獸藥殘留、毒素等風險物質，在食品中往往是常量存在，ppm級的檢出限足以滿足檢測要求，其發(fā)展方向在于縮短檢測時間，降低假陰性率。本研究建立的競爭ELISA法采用辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，不需使用二抗，節(jié)約了檢測時間，為預防蛋制品過敏的發(fā)生提供了有效的檢測手段，并為制定我國食品過敏原標簽管理奠定了一定的技術基礎。

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