志賀氏菌基于核酸序列恒溫擴(kuò)增檢測方法研究

李宏 姜英輝 張健 趙麗青 雷質(zhì)文 梁成珠

(1.中國合格評定國家認(rèn)可委員會 北京 100062;2.山東出入境檢驗檢疫局)

1 前言

志賀氏菌(Shigella spp.)俗稱痢疾桿菌，是引起人細(xì)菌性痢疾的腸道病原菌。按照抗原結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)的不同，可分為痢疾、福氏、鮑氏和宋內(nèi)氏志賀菌。志賀氏菌只需少量就可以發(fā)病，極易引起爆發(fā)性流行，尤其對幼兒可引起急性中毒性菌痢。由于該菌的死亡率高，對人類生命安全和社會穩(wěn)定有較大影響，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，每年全球痢疾的發(fā)病人數(shù)高達(dá)2億，其中1.632億分布于發(fā)展中國家，是危害最廣的流行病之一［1］。因此，開發(fā)一種快捷的檢測方法對志賀氏菌的防控將有很大的意義。

志賀氏菌檢測的主要方法有生理生化鑒定技術(shù)［2］、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)［3］和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR法)［4］等，前兩種方法操作繁瑣、檢驗周期長、工作量大，PCR方法雖然快速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。依賴核酸序列恒溫擴(kuò)增(Nucleic Acid Sequence－based Amplification，NASBA)技術(shù)是一項以核酸序列中RNA為模板的快速恒溫擴(kuò)增技術(shù)［5］，本研究嘗試選取志賀氏菌的基因ipaH作為檢測靶基因［6］，自行設(shè)計特異性引物，建立檢測志賀氏菌的NASBA檢測方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗菌株

本研究所用的11株實驗菌株(表1)分別購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)和中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(CMCC)。

表1 試驗用菌株

4腸炎沙門氏菌 S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s A T C C 1 3 0 6 7 1 5小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 Y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a C M C C(B)5 2 2 0 7 1 6大腸埃希氏菌 E s c h e r i c h i a c o l i A T C C 2 5 9 2 2 1 7弗氏檸檬酸桿菌 C i t r o b a c t e r f r e u n d i i A T C C 4 3 8 6 4 1 8產(chǎn)酸克雷伯氏菌 K l e b s i e l l a o x y t o c a A T C C 4 3 1 6 5 1 9陰溝腸桿菌 E n t e r o b a c t e r c l o a c a e A T C C 7 0 0 3 2 3 1 1 0 氣味沙雷氏菌 S e r r a t i a o d o r i f e r a A T C C 3 3 0 7 7 1 1 1 副溶血性弧菌 V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s A T C C 1 7 8 0 2 1

2.1.2 主要試劑

AMV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶、RNase抑制劑、RNaseH:美國NEB公司(New England Biolabs Inc.);RNAMaid:維格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司;通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測板:杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒:北京天根生物工程公司。

2.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSAYB)、堿性蛋白胨水、氯化鈉蔗糖瓊脂等:北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

2.2 方法

2.2.1 菌種活化

將表1所示11株菌株從－70℃保存條件下取出，1－10號菌株接種到營養(yǎng)肉湯中復(fù)蘇培養(yǎng)16h;將復(fù)蘇培養(yǎng)液接種到TSA－YE瓊脂，36℃ ±1℃，培養(yǎng)24h備用。副溶血性弧菌接種到堿性蛋白胨水中復(fù)蘇培養(yǎng)16h;將復(fù)蘇培養(yǎng)的菌懸液接種至氯化鈉蔗糖瓊脂，36℃ ±1℃，培養(yǎng)24h備用。

2.2.2 引物設(shè)計與合成

本研究根據(jù)美國國家生物信息中心(NCBI)上已公布的志賀氏菌的ipaH基因序列(GenBank ACCESSION:M76445)，采用 Primer Premier5.0引物設(shè)計軟件，并通過Blast軟件比對，設(shè)計一對特異性擴(kuò)增引物和一條探針如下:

F:5'－GCAGTCTTTCGCTGTTGCT －3' 5'端標(biāo)記生物素;

R:5'－AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGATGGACCAGGAGGGTTTT－3

T:5'－GTCCATCCCCTATAGTGAGTCG－3'3'端標(biāo)記FITC。

引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.2.3 細(xì)菌模板DNA提取

按傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分別增菌培養(yǎng)表1中的11株實驗菌株。各取試驗菌株的培養(yǎng)液1 mL，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取細(xì)菌DNA，保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 NASBA 方法的建立、優(yōu)化及驗證

［7］建立反應(yīng)體系，為了實現(xiàn)以DNA作為檢測目標(biāo)，對模板進(jìn)行了預(yù)處理，同時對影響NASBA擴(kuò)增的因素如反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、dNTPs、NTPs進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.4.1 模板預(yù)處理

反應(yīng)體系(25μL):10×buffer［200 mM Tris－HCl pH8.8，100 mM KCl，100 mM(NH4)2SO4，20 mM MgCl2］2.5 μL、模板 DNA 5 μL、引物 F 和 R(10 μmol/L)各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL、Taq Platinum DNA Ploymerase(2500 U/mL)0.5μL，用RNase－free雙蒸水補(bǔ)至25μL。

采用以上反應(yīng)體系對提取的DNA進(jìn)行處理，產(chǎn)物用于NASBA模板。

2.2.4.2 NASBA 擴(kuò)增

反應(yīng)體系(25 μL):10×buffer［40 mM Tris－HCl pH 8.5，100 mM KCl，12 mM MgCl2，5 mM DTT］2.5 μL、DMSO 2.5 μL、模板 DNA 5 μL、引物 F 和 R(10 μmol/L)各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)0.5 μL、NTPs(2.5 mmol/L)1.0 μL、BSA(10 mg/ml)0.25 μL、T7 RNA聚合酶(50000 U/mL)0.8 μL、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(10000 U/mL)0.8 μL、RNase 抑制劑(40000 U/mL)0.5 μL、RNaseH(500 U/mL)0.4 μL，用 RNase－free雙蒸水補(bǔ)至25μL。

反應(yīng)程序:反應(yīng)液在41℃水浴中孵育90 min;反應(yīng)結(jié)束后，加入RNA保護(hù)劑RNAMaid 1.5μL，探針T(10 μmol/L)1 μL，混勻，94 ℃水浴3 min，56 ℃水浴2 min。

2.2.4.3 方法驗證

按照建立及優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對3株志賀氏菌陽性菌株進(jìn)行檢測，以驗證所建方法的可行性。

2.2.5 產(chǎn)物檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物利用通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測板檢測［8］。核酸擴(kuò)增完成后，在反應(yīng)管中加入探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。把檢測板水平放置在操作臺上，取雜交產(chǎn)物10μL加入檢測板的樣品孔中，再加入100μL緩沖液進(jìn)行層析，10 min左右判讀結(jié)果。

通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測板的上C為質(zhì)控區(qū)，T為檢測區(qū)。檢測板在質(zhì)控區(qū)C和檢測區(qū)T均出現(xiàn)紅色條帶，為陽性結(jié)果，表明樣本中含有檢測的目標(biāo)物;僅在質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)紅色條帶，為陰性結(jié)果，表明樣本中沒有檢出目標(biāo)物;質(zhì)控區(qū)C和檢測區(qū)T內(nèi)均無紅色條帶出現(xiàn)，表明快速檢測板失效。

2.2.6 特異性實驗

用已建立的NASBA方法對表1所列的3株志賀氏菌和其他非志賀氏菌共計11株實驗菌株模板DNA進(jìn)行NASBA擴(kuò)增，利用通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測板檢測產(chǎn)物，確定特異性。

2.2.7 靈敏度實驗

將宋氏志賀氏菌CMCC(B)51592標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)，增菌液用0.85%生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備不同濃度的菌懸液;對菌懸液進(jìn)行平板計數(shù)。同時取各稀釋度的1mL菌懸液提取DNA，提取的DNA進(jìn)行NASBA擴(kuò)增，利用通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測板檢測產(chǎn)物，確定靈敏度。

3 結(jié)果

3.1 NASBA 方法驗證

檢測結(jié)果顯示，3株志賀氏菌試驗菌株的NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物，采用核酸擴(kuò)增物快速檢測板檢測，在檢測板的質(zhì)控區(qū)C和檢測區(qū)T均出現(xiàn)紅色條帶，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)結(jié)果(圖1)，表明本所研究建立和優(yōu)化的NASBA方法可用于志賀氏菌的檢測。

圖1 志賀氏菌的NASBA檢測結(jié)果

3.2 特異性實驗

用3株志賀氏菌陽性菌株和8株非志賀氏菌來檢驗NASBA方法的特異性。采用通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測板檢測，3株志賀氏菌陽性菌株經(jīng)NASBA擴(kuò)增后，均呈現(xiàn)陽性結(jié)果，而非志賀氏菌菌株則呈現(xiàn)陰性反應(yīng)結(jié)果，如圖2所示。檢測結(jié)果表明本研究建立的NASBA方法對于志賀氏菌有較好的特異性。

圖2 NASBA檢測志賀氏菌的特異性

3.3 靈敏度實驗

由計數(shù)結(jié)果可知，各梯度菌懸液含菌量為:6.3×108、6.3 × 107、6.3 × 106、6.3 × 105、6.3 × 104、6.3 ×103、6.3 ×102、6.3 ×101、6.3 ×100cfu/mL。檢測結(jié)果顯示(圖3)，至稀釋度6.3×101cfu/mL時沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，可以得出NASBA方法的最低檢測限為6.3×102cfu/mL。

圖3 NASBA方法檢測不同稀釋度宋氏志賀氏菌CMCC(B)51592 DNA的結(jié)果

4 討論

1991年，加拿大Can－gene公司首先報道NASBA恒溫擴(kuò)增技術(shù)［5］。NASBA技術(shù)是由兩個引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的特異性體外恒溫擴(kuò)增核苷酸序列的酶促過程，反應(yīng)主要依賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、T7 RNA聚合酶和兩個特殊設(shè)計的引物以及脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、核糖核苷三磷酸(NTP)和適宜的緩沖液。整個反應(yīng)在恒溫(41℃)條件下進(jìn)行，無需溫度循環(huán)，不會受到雙鏈DNA的污染。同時，由于外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不可能被擴(kuò)增，所以NASBA檢測方法的特異性得到了極大提高［9］。

目前大部分對NASBA檢測方法的研究，都以RNA為檢測目標(biāo)。而RNA的提取和保存對條件要求苛刻，限制了檢測方法的普及應(yīng)用。本研究選取ipaH基因作為檢測靶基因，建立志賀氏菌的NASBA檢測方法，加入了模板預(yù)處理步驟，使以DNA作為檢測目標(biāo)得以實現(xiàn)。

NASBA產(chǎn)物主要有酶聯(lián)凝膠技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)等檢測方法，上述方法存在操作復(fù)雜、需要昂貴儀器等問題，使NASBA檢測方法的應(yīng)用受到了限制。由于NASBA方法擴(kuò)增的主要產(chǎn)物為單鏈RNA，這就為用探針檢測提供了便利，因此本實驗嘗試了把NASBA技術(shù)與核酸薄膜層析檢測技術(shù)［8］進(jìn)行結(jié)合。實驗結(jié)果顯示，所建立的檢測方法具有較好的特異性和較高的檢測靈敏度，靈敏度為6.3×102cfu/mL，比傳統(tǒng)的PCR－瓊脂糖凝膠電泳檢測方法高1個數(shù)量級;反應(yīng)過程僅需普通的恒溫設(shè)備，1.5－2h即可得到理想的結(jié)果，檢測手段更為簡潔。

本研究所建立的NASBA檢測方法適合在細(xì)菌快速檢測方面應(yīng)用，在現(xiàn)場快速診斷產(chǎn)品的開發(fā)方面具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

參考文獻(xiàn)

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