Ras相關(guān)核蛋白和缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

肖 琳 楊 堅(jiān)

1.湖南省湘潭市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南湘潭 411100；2.湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南湘潭 411100

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2000年資料統(tǒng)計(jì)，在全世界范圍內(nèi)，每年新發(fā)胃癌人數(shù)為876 000例，占所有新發(fā)癌癥病例的9%，胃癌發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌和腸癌，居惡性腫瘤第四位[1]。我國(guó)每年有30 萬人死于該病，胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是生存率明顯降低的主要原因，研究表明癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移是多階段、多基因參與的結(jié)果[2]，但胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制至今尚不清楚，因此涉及腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的基因成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。Ras相關(guān)核蛋白（Ran）是Ras類原癌基因的一員，是一種分布于細(xì)胞核內(nèi)的小G蛋白，研究證實(shí)Ran是一種重要的細(xì)胞增殖調(diào)控因子，參與紡錘體的形成、DNA的復(fù)制和細(xì)胞核膜的重建等[3]。Azuma等[4]發(fā)現(xiàn)Ran是一種新的腫瘤相關(guān)抗原，其在多種腫瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)增高，但在胃癌組織中尚未見報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是在缺氧誘導(dǎo)下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下，HIF-1α的表達(dá)水平增高，可以調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)Ran與HIF-1α在胃癌中的表達(dá)及其相互關(guān)系，探討它們與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系，為臨床防治胃癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集湘潭市中心醫(yī)院2009年5月～2011年5月手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本及其配對(duì)的距癌灶5 cm以上的癌旁組織標(biāo)本各70例，標(biāo)本均經(jīng)組織病理確診，患者術(shù)前均未接受放化療。其中，男40例，女30例，年齡35～76歲，中位年齡58歲，胃癌患者臨床分期按2003年國(guó)際抗癌聯(lián)盟 （UICC）頒布的胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期7例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例，Ⅳ期9例；胃癌分化程度：低分化腺癌26例，中分化腺癌29例，高分化腺癌15例；胃癌浸潤(rùn)深度：浸潤(rùn)黏膜層及黏膜下層（T1）5例，浸潤(rùn)固有肌層（T2）19例，浸潤(rùn)漿膜層（T3）34例，浸潤(rùn)?quán)徑鞴倩蚪M織（T4）12例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無轉(zhuǎn)移27例，有轉(zhuǎn)移43例。

1.2 主要試劑

鼠抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人Ran多克隆抗體及其他相關(guān)試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

每個(gè)石蠟標(biāo)本4 μm厚度連續(xù)切片，攤片后，切片放置于60℃溫箱烘烤2 h預(yù)處理。采用免疫組織化學(xué)染色PV9000二步法，具體步驟如下：切片60℃預(yù)熱30 min。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化（二甲苯脫蠟10 min×2，梯度酒精水化95%3 min×3，80%3 min，70%3 min，蒸餾水 5 min×2）。 煮沸修復(fù)：取一定量枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）于不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰，切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱6 min），計(jì)時(shí)2 min，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，先用蒸餾水沖洗3 min×3，然后用PBS（pH=7.2～7.4）沖洗 3 min×2。 3%過氧化氫室溫下孵育 10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3 min×3。除去PBS液，滴加一抗，室溫下孵育1 h，PBS沖洗3 min×3。除去PBS液，滴加聚合物輔助劑，室溫下孵育20 min，PBS沖洗3 min×3。除去PBS液，滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體，室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3。除去PBS液，滴加新鮮配制的DAB底物顯色液，顯微鏡下觀察3～5 min，至出現(xiàn)陽性結(jié)果而又無明顯背景著色，中止反應(yīng)，自來水沖洗。蘇木素復(fù)染，1%鹽酸分化，氨水反藍(lán)，自來水沖洗，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗，步驟同上，作陰性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

以細(xì)胞胞漿或胞膜出現(xiàn)黃色顆粒為陽性，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞所占百分比計(jì)分，以計(jì)分之和來判斷結(jié)果，按染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陰性為0分， 陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分，10%～24%為2分，25%～49%為3分，≥50%為 4分。按計(jì)分之和分為 4個(gè)等級(jí)：-（0）；+（1，2）；++（3，4）；+++（5，6），計(jì)分之和＞2 分為高表達(dá)，≤2 為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)相關(guān)資料采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ran和HIF-1α在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況

Ran和HIF-1α的陽性表達(dá)主要在細(xì)胞核，部分胞質(zhì)中也可見陽性表達(dá)，胃癌組織中Ran和HIF-1α的陽性表達(dá)率分別為45.71%.和77.14%，與正常胃黏膜組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表1～2。

2.2 Ran和HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

2.2.1 Ran在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系Ran 在 T1、T2、T3、T4 的陽性表達(dá)率分別為 20.00%（1/5）、26.32%（5/19）、47.06%（16/34）及 83.33%（10/12）；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的陽性表達(dá)率分別為 14.29%（1/7）、33.33%（7/21）、51.52%（17/33）及 77.78%（7/9）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為62.79%（27/43），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為18.52%（5/27），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P ＜ 0.05）。但 Ran表達(dá)與腫瘤分化程度無明顯關(guān)系，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.2.2 HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 HIF-1α 在 T1、T2、T3、T4 的陽性表達(dá)率分別為 40.00%（2/5）、63.16%（12/19）、85.29%（29/34） 及 91.67%（11/12）；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的陽性表達(dá)率分別為42.86%（3/7）、66.67%（14/21）、84.85%（28/33）及 100.00%（9/9）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為88.37%（38/43），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為59.26%（16/27），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。但HIF-1α表達(dá)與腫瘤分化程度無明顯關(guān)系，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表4。

2.3 Ran和HIF-1α在胃癌組織中相關(guān)性

Ran和HIF-1α在胃癌中的表達(dá)，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（r=0.363，P＜0.05），兩者呈正相關(guān)。見表5。

表1 Ran在胃癌組織和正常胃黏膜組織中免疫組化染色的情況

3 討論

Drivas等[5]首次在人畸胎瘤細(xì)胞cDNA中發(fā)現(xiàn)Ran的開放閱讀框，并分離純化證實(shí)Ran具有GTP酶活性，研究發(fā)現(xiàn)Ran可激活Cdc2/cyclin B蛋白激酶使細(xì)胞進(jìn)入有分裂期[6]，Ran的功能異?？梢源龠M(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生[7]，這些研究提示Ran可能參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生，Morgarr-lappe等[8]利用肺癌細(xì)胞系H1299 對(duì)3 700個(gè)基因的siRNA文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)Ran siRNA可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，Honma等[9]發(fā)現(xiàn)Ran的表達(dá)下調(diào)可引起人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡，但是Ran在胃癌組織中的表達(dá)未見報(bào)道，本研究表明Ran在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且胃癌分期越晚、浸潤(rùn)越深、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移其表達(dá)水平越高，結(jié)果表明Ran可能參與了胃癌早期癌變的發(fā)生過程，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表2 HIF-1α在胃癌組織和正常胃黏膜組織中免疫組化染色情況

表3 Ran與臨床病理特征間的關(guān)系

表4 HIF-1α與臨床病理特征間的關(guān)系

表5 Ran與HIF-1α的相關(guān)性

HIF-1 是缺氧調(diào)節(jié)下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)產(chǎn)生的一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，HIF-1 主要由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成，其中,HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，它決定HIF-1 的活性[10]，其靶基因涉及腫瘤細(xì)胞能量代謝、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等，Zhong等[11]分析了179例不同類型腫瘤標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在包括前列腺癌、乳腺癌、胃癌等13 種腫瘤標(biāo)本中可見HIF-1α呈不同程度的表達(dá)，而在相應(yīng)的良性腫瘤中沒有檢測(cè)到HIF-1α，Zhong的研究在本實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)，本研究顯示HIF-1α與胃癌臨床分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這說明HIF-1α在胃癌中的過度表達(dá)對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能有一定的意義。

關(guān)于Ran和HIF-1α兩者之間的研究甚少，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者具有正相關(guān)性，這提示Ran與HIF-1α存在著調(diào)控關(guān)系，HIF-1α/Ran通路在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖過程中具有十分重要的作用，兩者在胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中可能具有協(xié)同作用，由此筆者認(rèn)為Ran和HIF-1α共同參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，HIF-1α可能通過上調(diào)Ran蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移，兩者之間的相互作用還需進(jìn)一步研究。

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