鹿蹄草素酯類衍生物的合成及抗菌活性研究

何 勇 李家明

1.安徽省池州市人民醫(yī)院藥劑科，安徽池州 247000；2.安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥 230031

氫醌類化合物（hydroquinone）作為醌類物質(zhì)的一類，易氧化成對苯醌類衍生物，還原又恢復(fù)為原來的氫醌類，所以它們既起到了傳遞電子的作用，又能影響某些生化反應(yīng)的過程[1-2]。鹿蹄草素（Pyrolin）是一種有代表性的氫醌類化合物，抗菌作用較強，抗菌譜廣，毒性低，對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等都有抑制作用，臨床試驗表明其對呼吸道、尿道、消化道及創(chuàng)口感染等都有良好的療效，對真菌及某些昆蟲也有殺滅作用[3-5]。體外藥效學(xué)試驗結(jié)果表明，鹿蹄草素作為一種廣譜抗菌藥物，對G+和G－菌的體外抑菌效果均超過青霉素[6]。艾啟俊等[7]通過對鹿蹄草素作用下的金黃色葡萄球菌生長曲線、膜通透性和結(jié)構(gòu)進行研究發(fā)現(xiàn)，鹿蹄草素的抑菌性和殺菌功能與其對金黃色葡萄球細胞膜和細胞壁結(jié)構(gòu)的破壞直接相關(guān)。但鹿蹄草素在生物體內(nèi)極易被肝臟氧化酶系代謝成醌類而失去活性。徐文方等[6]對鹿蹄草素進行了體內(nèi)外藥效學(xué)研究，結(jié)果表明鹿蹄草素在家兔體內(nèi)的代謝速度極快。由于鹿蹄草素在生物體內(nèi)易失活，半衰期短，代謝速度快，因此從延長藥物作用時間、減少給要次數(shù)、方便患者用藥的方面考慮，利用前藥原理，將鹿蹄草素的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)中兩個酚羥基酰化保護，合成系列鹿蹄草素酰基化合物，使其進入體內(nèi)后，經(jīng)血清酯酶降解，緩慢釋放出母體藥物鹿蹄草素而發(fā)揮抗菌作用，在預(yù)期達到理想的體內(nèi)藥效的同時，還可降解并釋放一些其他基團，發(fā)揮其他基團的藥效作用。

1 儀器及試藥

DF-101B集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（黃峪予華儀器制造廠）；WRS-1B數(shù)字熔點儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），溫度未校正；CP225D十萬分之一電子天平（Sartorious）；LCQ ADVANTAGE MAX液質(zhì)連用質(zhì)譜儀 （FINNIGAN公司）；Bruker 300 MHz超導(dǎo)核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑；Nicolet Avatar 370DTGS型紅外光譜儀 （therm-electron corporation）。

鹿蹄草素（自制，含量為 98%），mp.127.2～127.6℃（文獻參考值為mp.126～127℃[8]），煙酸 （鄭州藍宇化工有限公司，100 g/瓶），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹿蹄草素衍生物的合成方法

2.1.1 雙乙?；固悴菟氐暮铣?在250 mL圓底燒瓶中加入鹿蹄草素（5.00 g，0.040 mol）、乙醚（150 mL），攪拌溶解后，加乙酸酐（10.0 mL，0.106 mol）、吡啶（10 mL），室溫攪拌反應(yīng) 24 h，TLC監(jiān)控反應(yīng)。待原料基本反應(yīng)完全后，向反應(yīng)液中加冰水20 mL，用分液漏斗分離出乙醚層，先后用1%NaHCO3、飽和CuSO4溶液、冰水洗滌，減壓蒸出乙醚，殘留物用少量乙酸乙酯溶解，經(jīng)硅膠G層析柱分離純化，得白色晶體（7.3g，86.9%），mp.43.9～44.7℃。1H-NMR （CDCl3，300 MHz）δ：2.17（s，3H），2.28（s，3H），2.31（s，3H），6.93（m，3H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz）δ：169.3，169.0，148.1，146.7，131.4，123.9，122.6，119.8，21.0，16.2；IR（KBr，cm-1）υ：2936.3，1756.3，1617.1，1496.4，1212.5，867.3；ESI-Mass m/z：209.12（M++H）。

2.1.2 雙丙?；固悴菟氐暮铣蒣9]稱取鹿蹄草素 （5.00 g，0.040 mol）、二甲氨基吡啶（DMAP，1.50 g），加入 250 mL 三頸燒瓶中，加入苯（125 mL）、丙酰氯（11.9 mL，0.136 mol），回流（85℃）5 h，TLC 監(jiān)控反應(yīng)。 反應(yīng)結(jié)束時，在加熱回流（85℃）攪拌條件下，緩慢滴加飽和NaHCO3溶液調(diào)pH至堿性，冰水洗滌，分離苯層，干燥，除苯。剩余物用少量乙酸乙酯溶解，用硅膠G層析柱分離純化，得白色固體（6.2 g，65.7%），mp.49.0～51.0℃。1H-NMR（CDCl3，300 MHz） δ：1.27（q，6H），2.16（s，3H），2.53～2.64（m，4H），6.90～7.02（m，3H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz）δ：172.9，172.6，148.2，146.8，131.4，123.9，122.7，119.8，27.7，27.6，16.3，9.2，9.1；IR（KBr，1/cm） υ：2 986.6，2 943.7，1 764.5；ESI-Mass m/z：258.92（M++H）。

2.1.3 雙苯甲?；固悴菟氐暮铣?在150 mL三頸燒瓶中加鹿蹄草素（3.00 g，0.024 mol）、苯（75.0 mL）、苯甲酰氯（8.4 mL，0.072 mol）、吡啶（6 mL），攪拌下，加熱回流反應(yīng) 5 h，TLC 監(jiān)控反應(yīng)。待原料基本反應(yīng)完全后，減壓蒸出苯，殘留物用氯仿溶解，加飽和NaHCO3溶液50 mL攪拌20 min，分出氯仿層，用冰水洗滌，氯仿層干燥，減壓回收氯仿，殘留物用硅膠G層析柱分離純化，得白色晶體。45℃干燥12 h，得白色晶體 7.2 g （89.7% ），mp.119.8～120.2℃ 。1H-NMR （CDCl3，300 MHz） δ：2.27 （s，3H），7.13～7.26 （m，3H），7.50～7.56 （m，4H），7.64～7.66 （m，2H），8.19～8.24 （m，4H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MH z） δ：165.2，164.9，148.6，147.2，133.7，131.9，124.2，123.0，120.1，16.5；IR（KBr，cm-1）υ：2 924.2，1 735.0，1 594.6，1 451.4，1 260.8；ESI-Mass m/z：333.25 （M++H）。

2.1.4 雙煙?；固悴菟氐暮铣?在帶尾氣吸收裝置的100 mL圓底燒瓶中，加入煙酸（10.0 g，0.081 mol）、SOCl2（40 mL），攪拌下加熱回流3 h，減壓蒸出SOCl2，得淡黃色固體煙酰氯。將煙酰氯轉(zhuǎn)移至250 mL三頸燒瓶中，在冰浴冷卻下，邊攪拌邊緩慢滴加鹿蹄草素吡啶溶液[鹿蹄草素（4.0 g，0.032 mol）用吡啶（20 mL）溶解]，加完后再加吡啶（80 mL）。加熱至 90℃攪拌反應(yīng)5 h，TLC監(jiān)控反應(yīng)。待原料基本反應(yīng)完全后，減壓蒸去吡啶，殘留物用氯仿溶解，冰水洗滌，分離出氯仿層經(jīng)鈉干燥，抽濾后減壓回收氯仿，得白色略帶黃色固體。將所得固體用無水乙醇重結(jié)晶。產(chǎn)品在48℃干燥12 h，得雙煙?；固悴菟匕咨w 7.5 g，收率為 69.4%，mp.144.0～144.3℃；1H-NMR（CDCl3，300 MHz） δ：2.28（s，3H），7.14～7.26（m，3H），8.46～8.50（m，2H），8.88（s，2H），9.42（d，2H，J=8.64 Hz）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz） δ：163.8，163.5，148.2，146.9，131.9，123.5，122.9，120.1，16.5；IR（KBr，cm-1） υ：2 996.3，1738.1，1586.9，1495.1，895.5，803.2；ESI-Mass m/z：335.33（M++H）。

2.1.5 雙乙酰水楊?；固悴菟氐暮铣?在帶尾氣吸收裝置100 mL 圓底燒瓶中，加入乙酰水楊酸（12.0 g，0.067 mol）、氯仿（50 mL）、SOCl2（10 mL），攪拌下加熱回流反應(yīng) 5 h，減壓蒸出氯仿和SOCl2，得無色液體乙酰水楊酰氯。在150 mL三頸燒瓶中，加鹿蹄草素（3.00 g，0.024 mol）、吡啶（60 mL）溶解，在冰浴冷卻下，邊攪拌邊緩慢滴加乙酰水楊酰氯，滴加完畢后于室溫攪拌反應(yīng)12 h。TLC監(jiān)控反應(yīng)，待原料基本反應(yīng)完全后，減壓蒸去吡啶，殘留物用氯仿溶解，先后用10%鹽酸、冰水洗滌，分離出氯仿層，經(jīng)干燥，抽濾，減壓回收氯仿，殘留物用乙酸乙酯重結(jié)晶，得褐色固體。用硅膠G層析柱分離純化，氯仿∶甲醇（100∶1，V/V）洗脫劑，收集產(chǎn)物，減壓回收溶劑后得白色晶體。45℃干燥12 h，得雙乙酰水楊?；固悴菟?.2 g，收率為 38.7%，mp.200.0～202.0℃。1H-NMR（CDCl3，300 MHz） δ：2.24 （s，3H），2.32 （s，3H），7.08 ～7.21 （m，5H），7.65～7.67（m，2H），8.20～8.25（m，2H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz）δ：163.0，162.6，148.3，147.0，132.1，124.2，123.1，120.3，16.5；IR（KBr，cm-1） υ：1 762.8，1 739.8，1 487.9，1 446.3，1 249.5；ESI-Mass m/z：471.01（M++Na）。

2.2 鹿蹄草素衍生物的藥理實驗

2.2.1 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2 對大腸桿菌感染小鼠的保護作用 取體重18～22 g昆明種小鼠70只（由南京醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號：SCXK（蘇）2002-0031），雌雄各半，按體重隨機分成對照組、鹿蹄草素組（Ⅰ組）、雙乙?；?LTCS組（Ⅱ組）、雙丙?；?LTCS組（Ⅲ組）、雙苯甲?；疞TCS組（Ⅳ組）、雙煙?；疞TCS組（Ⅴ組）、雙乙酰水楊?；疞TCS組（Ⅵ組），根據(jù)小鼠灌胃大腸桿菌菌液0.6 mL（細菌濃度為3 ×109cfu/mL），各組分別按劑量灌胃給藥0.1 mL/10 g體重，連續(xù)3 d，連續(xù)觀察，統(tǒng)計7 d內(nèi)小鼠的死亡情況。結(jié)果見表1。

表1 各組對大腸埃希菌感染小鼠的保護作用

由表1 可見，腹腔注射大腸埃希菌菌液后，對照組小鼠全部死亡（死亡率為100%，存活率為0），而用藥后各劑量組均不完全死亡（存活率為30%～60%），其中鹿蹄草素組（Ⅰ組）存活率為30%，而雙乙?；疞TCS組（Ⅱ組）為50%，雙丙?；疞TCS組（Ⅲ組）為40%，雙苯甲?；疞TCS組（Ⅳ組）為40%，雙煙酰化LTCS組 （Ⅴ組）為50%，雙乙酰水楊酸化LTCS組（Ⅵ組）為60%，上述各組與Ⅰ組相比存活率均明顯提高（P<0.05），其中Ⅵ組作用最為明顯（P<0.01）。

2.2.3 對金黃色葡萄球菌感染小鼠體內(nèi)的保護作用[7]取體重18～22 g昆明種小鼠70只（由南京醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號：SCXK（蘇）2002-0031），雌雄各半，按體重隨機均分成對照組、鹿蹄草素組（Ⅰ組）、雙乙酰化LTCS組（Ⅱ組）、雙丙?；疞TCS組（Ⅲ組）、雙苯甲酰化LTCS組（Ⅳ組）、雙煙?；疞TCS組（Ⅴ組）、雙乙酰水楊?；疞TCS組（Ⅵ組），根據(jù)小鼠灌胃金黃色葡萄球菌菌液0.8 mL（細菌濃度為3 ×109cfu/mL），同時，各組分別按劑量灌胃給藥0.1 mL/10 g體重，連續(xù)3 d，連續(xù)觀察，統(tǒng)計7 d內(nèi)小鼠的死亡情況。結(jié)果見表2。

表2 各組對金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護作用

由表2 可知，腹腔注射金黃色葡萄球菌菌液后，對照組小鼠全部死亡（死亡率為100%，存活率為0），而用藥后各劑量組均不完全死亡（存活率為50%～70%），其中鹿蹄草素組（Ⅰ組）存活率為50%，而雙乙?；疞TCS組（Ⅱ組）為60%，雙丙?；疞TCS組（Ⅲ組）為50%，雙苯甲?；疞TCS組（Ⅳ組）為60%，雙煙酰化LTCS組（Ⅴ組）為60%，雙乙酰水楊酸化LTCS組（Ⅵ組）為70%，與Ⅰ組比較，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組存活率均明顯提高（P<0.05）。

3 討論

為了解決鹿蹄草素體內(nèi)代謝過快的問題，筆者應(yīng)用前藥原理，對鹿蹄草素的酚羥基進行保護，做成系列鹿蹄草素?；衔?，分別是雙乙?；固悴菟?、雙丙?；固悴菟?、雙苯甲?；固悴菟?、雙煙酰化鹿蹄草素、雙乙酰水楊?；固悴菟兀⑶彝ㄟ^IR、1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS確證了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。其中雙苯甲?；固悴菟?、雙煙酰化鹿蹄草素、雙乙酰水楊?；固悴菟貫樾禄衔?。

鹿蹄草素及其衍生物體內(nèi)抗菌試驗中，鹿蹄草素及其衍生物能夠使大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率顯著提高，說明鹿蹄草素及其衍生物有較好的抗菌作用，而雙乙酰化LTCS組、雙丙?；疞TCS組、雙苯甲?；疞TCS組、雙煙?；疞TCS組、雙乙酰水楊酸化LTCS組的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率，與鹿蹄草素組比較，均有所提高，說明鹿蹄草素衍生物抗菌作用強于鹿蹄草素，可能是衍生物在體內(nèi)經(jīng)水解酶系作用緩慢釋放鹿蹄草素，解決了鹿蹄草素半衰期過快等不足的緣故。

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