懷牛膝中化學(xué)成分的分離與鑒定

楊柳，姜海，楊炳友，王秋紅，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

懷牛膝為莧科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的干燥根，主產(chǎn)于河南。具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，逐瘀通經(jīng)，引血下行之功效，用于腰膝酸痛，筋骨無(wú)力，經(jīng)閉癥瘕，肝陽(yáng)眩暈［1］。藥理研究表明，懷牛膝具有抗生育、鎮(zhèn)痛、抗炎、增強(qiáng)免疫功能、抗衰老等作用［2－3］。前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，牛膝水煎液的大孔樹(shù)脂50%乙醇洗脫組分具有抗骨質(zhì)疏松活性，為了闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)牛膝大孔樹(shù)脂50%乙醇洗脫組分進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，曾報(bào)道從該組分中分別分離得到了新的甾酮類化合物［4］，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用硅膠柱色譜、ODS反相柱色譜、制備型HPLC等色譜手段，進(jìn)一步從牛膝中分離得到5個(gè)單體化合物，其中化合物1為首次從該植物中分離得到。

1 儀器和材料

Bruker－400型核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司，1H －NMR:400 MHz，13C －NMR:100 MHz);ACQUITY Ultra Performance LCTM液質(zhì)聯(lián)用色譜儀;Delta 600－2487制備型 HPLC(美國(guó)Waters公司);制備型色譜柱 Hypersil－ODSⅡ(10μm，20mm ×300mm，大連依利特公司);硅膠(青島海洋化工廠，80～100，200～300目);薄層色譜用硅膠板(Silica gel60F254)和反相薄層板(Rp－18)(德國(guó) Merck公司);柱色譜用反相ODS－AM(日本YMC公司);D101大孔吸附樹(shù)脂(南開(kāi)大學(xué)化工廠);色譜層析用化學(xué)試劑為分析純(天津試劑一廠)。

Tab.1 13C －NMR data of compounds 1－2(in C5D5N，100 MHz，δ in ppm)

藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室王振月教授鑒定為莧科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的干燥根。原植物標(biāo)本保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室。

2 提取分離

將干燥的牛膝3kg，以水煎煮提取3次，每次2h，濾過(guò)，合并水提液，減壓回收，得水溶液提取物。水溶液提取物經(jīng)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱色譜，用H2O、50%EtOH和95%EtOH依次洗脫，其中50%EtOH洗脫液經(jīng)減壓回收得50%EtOH洗脫組分(90g)。50%EtOH洗脫組分經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷－甲醇溶劑梯度洗脫，得到8個(gè)餾分(Fr.1－8)。Fr.2經(jīng)正相硅膠柱色譜(二氯甲烷－甲醇)及反相ODS(甲醇－水)等方法得到化合物 3(54mg)、4(21mg)、5(27mg)。Fr.5經(jīng)反相ODS(甲醇－水)及制備型HPLC(甲醇－水)等方法得到化合物1(32mg)、2(30mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色粉末，UV λmax:241.5nm，HR －ESI－MS(m/z):485.288 9［M+Na］+，表明其分子量為462，推測(cè)其分子式為 C27H42O6。1H －NMR(C5D5N)譜中，在 δ1.21、1.06、1.56 和 1.66 處出現(xiàn) 4 個(gè)甲基信號(hào)，在 δ6.25(1H，d，J=2.4Hz)處可見(jiàn) 1 個(gè)烯氫質(zhì)子的信號(hào)。13C－NMR(C5D5N)譜中，出現(xiàn)27個(gè)碳信號(hào)，其中δ203.0為α、β－不飽和羰基上的一個(gè)酮羰基信號(hào)，δ166.1、122.0為三取代的雙鍵碳信號(hào)，通過(guò)以上數(shù)據(jù)初步推測(cè)為含27個(gè)碳的植物甾酮類化合物，具有甾酮類化合物的特征信號(hào)。除此以外，在δ4.74(1H，brs)和4.77(1H，brs)處還分別出現(xiàn)2個(gè)烯氫信號(hào)。據(jù)此推測(cè)化合物1中不僅存在α、β不飽和羰基結(jié)構(gòu)外，另外還具有一個(gè)末端雙鍵。通過(guò)13C－NMR和HSQC譜的綜合解析，可知末端雙鍵存在于C25和C26間。將化合物1的1H－NMR、13C－NMR譜數(shù)據(jù)(見(jiàn)Table.1)與文獻(xiàn)報(bào)道的25，26－二去氫坡那甾酮A波譜數(shù)據(jù)［5］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物1為25，26－二去氫坡那甾酮 A(25，26－dehydroponasteroneA)。

化合物2:白色粉末，UV λmax:242.0nm，HR －ESI－MS(m/z):357.168 8［M+Na］+，表明其分子量為334，推測(cè)其分子式為 C19H26O5?；衔?的1HNMR和13C－NMR(C5D5N)譜中同樣出現(xiàn)了甾酮類化合物的特征信號(hào)，結(jié)合1H、13C－NMR譜，推測(cè)化合物2為含有19個(gè)碳的甾酮類化合物，可能其C17位的側(cè)鏈被氧化消失。δ200以上給出1個(gè)孤立的飽和羰基碳信號(hào)δ217.2，表明分子中具有五元環(huán)酮結(jié)構(gòu)。將化合物2的碳譜數(shù)據(jù)與化合物1進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其C1－C15位的化學(xué)位移基本沒(méi)有變化，而C17位變化很大，推測(cè)C17位側(cè)鏈消失，并羰基化。將化合物 2的1HNMR、13C－NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的紅莧甾酮波譜數(shù)據(jù)［6］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物2為紅莧甾酮(rubrosterone)。

化合物3:黃色粉末，Dragendorff反應(yīng)產(chǎn)生桔紅色沉淀，HR －ESI－ MS(m/z):359.124 1［M+Na］+，表明其分子量為336，推測(cè)其分子式為C20H18NO。13CNMR(CD3OD):δ106.6(C － 1)，150.0(C －2)，152.0(C －3)，109.4(C － 4)，28.2(C －5)，57.7(C － 6)，145.8(C －8)，152.2(C －9)，62.5(9 － OCH3)，146.4(C －10)，57.2(10 － OCH3)，121.9(C －11)，124.5(C－12)，128.1(C －13)。將化合物3的1H －NMR、13C－NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的小檗堿的波譜數(shù)據(jù)［7］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物3為小檗堿(berberine)。

化合物4:白色粉末，Molish反應(yīng)呈紫色，HR－ESI－MS(m/z):259.115 0［M+Na］+，表明其分子量為236，推測(cè)其分子式為 C10H20O6。13C－NMR(CD3OD):δ60.6(C －1)，32.6(C －2)，19.8(C －3)，14.1(C －4)，64.1(C －1')，101.2(C －2')，70.6(C －3')，72.1(C －4')，71.3(C －5')，65.0(C －6')。將化合物 4的1H－NMR、13C－NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的正丁基吡喃果糖苷的波譜數(shù)據(jù)［8］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物4為正丁基吡喃果糖苷(n－butyl－β－D－fructopyranoside)。

化合物5:無(wú)色片狀結(jié)晶，易溶于甲醇，HR－ESI－MS(m/z):277.142 4［M］+，表明其分子量為 278，推測(cè)其分子式為 C16H22O4。13C－NMR(CD3OD):δ132.4(C －1，2)，129.9(C －3，6)，133.6(C －4，5)，169.3(C －1')，66.6(C －1″)，31.7(C －2″)，20.3(C －3″)，14.1(C － 4″)。將化合物 5 的1H － NMR、13C －NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的鄰苯二甲酸二丁酯的波譜數(shù)據(jù)［9］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物5為鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:67.

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