干細(xì)胞因子及受體c－kit對(duì)A375細(xì)胞增殖和凋亡影響的體外研究

吳冬梅，岑 瑛

干細(xì)胞因子及受體c－kit對(duì)A375細(xì)胞增殖和凋亡影響的體外研究

吳冬梅，岑 瑛

目的 利用基因工程方法建立穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞因子受體(SCF/c-kit)的惡性黑素瘤A375細(xì)胞株，再給予外源性SCF/c-kit，觀察其對(duì)A375細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法 通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)c-kit的黑素瘤細(xì)胞株（hc-kit/A375），給予A375細(xì)胞和hc-kit/A375細(xì)胞外源性SCF，將所有的細(xì)胞分為A375組、A375-SCF組、hc-kit/A375組和hc-kit/A375-SCF組。應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的增殖和凋亡，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫組化方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9及腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)。結(jié)果 ①通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)能將c-kit-pcDNA3.1 neo重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入黑素瘤細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)c-kit的黑素瘤細(xì)胞株hckit/A375，hc-kit/A375細(xì)胞中c-kit表達(dá)明顯增加。②給予外源性SCF后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，以培養(yǎng)后第5天尤為顯著；細(xì)胞的凋亡率明顯增加，S期比例降低，且hc-kit/A375-SCF組尤明顯。③轉(zhuǎn)染后細(xì)胞及加入SCF干預(yù)組VEGF、MMP-9分泌減少，而TNF-α的分泌增加。結(jié)論 通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418篩選成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)c-kit的A375細(xì)胞株；通過(guò)增加A375細(xì)胞中SCF/c-kit的表達(dá)能改變腫瘤細(xì)胞對(duì)VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

黑素瘤，轉(zhuǎn)移性；干細(xì)胞因子；受體，干細(xì)胞因子；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；A375細(xì)胞

[J Pract Dermatol, 2012, 5(4):193-198]

近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與多種分子相關(guān)，如p53，bcl-2，F(xiàn)as/Fasl，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9，干細(xì)胞因子受體/c-kit（SCF/c-kit）等。干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (mast cell growth factor，MGF)等，是1990年以來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的造血生長(zhǎng)因子，主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞 (包括脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)產(chǎn)生[1-3]。SCF通過(guò)與其受體的相互作用發(fā)揮其生物學(xué)活性。干細(xì)胞因子受體即c-kit，屬于3型受體酪氨酸激酶亞家族，c-kit蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為 145 000，又稱CD117。SCF/c-kit信號(hào)通路在黑素瘤中起著重要作用，SCF通過(guò)與其配體c-kit的相互作用，對(duì)黑素細(xì)胞的存活、分化、增殖和移行等方面起調(diào)節(jié)作用。

本研究利用基因工程的方法建立穩(wěn)定表達(dá)c-kit的惡性黑素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞株，然后給予外源性SCF，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物活性的影響，從而為惡性黑素瘤的臨床治療提供一個(gè)新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人黑素瘤細(xì)胞系細(xì)胞A375，由四川大學(xué)華西醫(yī)院移植免疫實(shí)驗(yàn)室提供。A375細(xì)胞低表達(dá)c-kit；重組質(zhì)粒c-kit-WT pcDAN3.1 neo（ATCC公司，美國(guó)）；脂質(zhì)體lipofectine2000（Invitrogen公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系及其培養(yǎng) 人黑素瘤細(xì)胞系細(xì)胞A375在含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 c-kit質(zhì)粒的提取及構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)c-kit的A375細(xì)胞株 將重組質(zhì)粒c-kit-WT pcDAN3.1 neo進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用XhoⅠ及Bam H1限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定后，用lipofectine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將c-kit轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，并通過(guò)G418進(jìn)行抗性篩選陽(yáng)性克隆。采用有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達(dá)c-kit的A375細(xì)胞，并通過(guò)RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞中c-kit的表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞分組 本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為4組：A375組(A組)為標(biāo)準(zhǔn)A375細(xì)胞；A375-SCF組(AS組)為標(biāo)準(zhǔn)A375細(xì)胞+10 ng/ml SCF；hc-kit/A375組(H組)為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hc-kit的A375細(xì)胞；hc-kit/A375-SCF組(HS組)為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hc-kit的A375細(xì)胞 + 10 ng/ml SCF。

1.2.4 細(xì)胞增殖、凋亡的分析 將A375細(xì)胞和hckit/A375細(xì)胞接種于24孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁、伸展；按上述分組，AS組和HS組中每孔加入10 ng/ml的rhSCF；此后8 d連續(xù)用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的增殖情況，于酶標(biāo)比色計(jì)492 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值（A值）。每組3個(gè)復(fù)孔，取平均值，并繪制每組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

取細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上，擬傳代的A375細(xì)胞和hc-kit/A375細(xì)胞，按前述分組接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，AS組和HS組中加入10 ng/ml的rhSCF，37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)3 d，制成細(xì)胞懸液，用Annexin V/FITC雙染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞和hc-kit/A375細(xì)胞以相同的細(xì)胞濃度（5×104個(gè)/ml）分別接種于6孔板中，每種細(xì)胞均接種6孔，其中3孔加入10 ng/ ml的SCF，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，PI染色，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.2.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞中VEGF、MMP-9及腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平 按分組分別收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清，置于15 ml離心管中，1 000 r/min離心4 min，取上清液，分裝于EP管中，20 ℃保存。用VEGF、MMP-9及TNF-α ELISA試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞的VEGF、MMP-9及TNF-α的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ ±s）表示，所有實(shí)驗(yàn)組間差異用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)c-kit的黑素瘤細(xì)胞株hc-kit/A375

采用c-kit-WT pcDNA3.1 neo重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞后，用G418進(jìn)行篩選獲得野生型人c-kit受體的細(xì)胞株hc-kit/A375細(xì)胞。提取hc-kit/A375細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以反應(yīng)產(chǎn)物為模板，P1、P2為上下游引物進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增出hc-kit cDNA第700～1 302 bp片段，而未轉(zhuǎn)染的A375細(xì)胞則沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)大小的片段，證明在 RNA水平檢測(cè)到外源性hc-kit受體的轉(zhuǎn)錄（圖1）。

用流式細(xì)胞儀分析hc-kit/A375細(xì)胞表面hc-kit受體的表達(dá)情況，結(jié)果hc-kit/A375細(xì)胞表面hc-kit受體分布明顯多于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，A組c-kit的表達(dá)為0.526±0.288，H組c-kit的表達(dá)為1.70±0.541（P＜0.05）（圖2），提示轉(zhuǎn)染后得到的細(xì)胞株表面c-kit受體的表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明c-kit被成功轉(zhuǎn)染入A375細(xì)胞。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 各組細(xì)胞的增殖曲線

采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后及rhSCF干預(yù)前后8 d細(xì)胞的增殖情況（圖3）。生長(zhǎng)曲線顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞（hc-kit/A375）的增殖能力明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（A375）。加入10 ng/ml的rhSCF后轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞的增殖能力明顯低于無(wú)干預(yù)組，且轉(zhuǎn)染后細(xì)胞（hc-kit/A375）的增殖能力明顯低于其他各組細(xì)胞。生長(zhǎng)至第5天時(shí)，H組、HS組、AS組與對(duì)照A組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。其中HS組細(xì)胞的增殖能力減弱最明顯，與其他各組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染增加黑素瘤細(xì)胞中c-kit的表達(dá)能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而加入外源性的SCF后該作用明顯增強(qiáng)。

2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

各組細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d后，用Annexin/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后hc-kit/A375細(xì)胞的凋亡率為2.7%，明顯高于未轉(zhuǎn)染組A375細(xì)胞（0.9%）。加入10 ng/ml的rhSCF后轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞的凋亡率（分別為1.6%，8.5%）明顯高于A組（0.9%），且轉(zhuǎn)染后細(xì)胞（hc-kit/A375）的凋亡率為8.5%，明顯高于其他各組細(xì)胞（圖4）。這說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染增加黑素瘤細(xì)胞中c-kit的表達(dá)，能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡； 而加入外源性的SCF后該作用明顯增強(qiáng)。

圖2 流式細(xì)胞儀分析A375細(xì)胞及hc-ki t/A375細(xì)胞表面c-ki t表達(dá)水平

圖3 M TT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況

2.4 細(xì)胞周期的檢測(cè)

流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。各細(xì)胞S期在細(xì)胞周期中所占比例依次為：A375(41.5%)＞A375-SCF(39.3%)＞ hc-kit/A375(32.2%)＞hc-kit/ A375-SCF(30.6%)。hc-kit/A375細(xì)胞的S期在細(xì)胞周期中所占比例明顯低于A375和A375-SCF細(xì)胞，而hc-kit/A375-SCF組細(xì)胞的S期在細(xì)胞周期中所占比例最低，提示hc-kit/A375和hc-kit/A375-SCF組細(xì)胞的增殖活躍程度受到明顯抑制。

2.5 細(xì)胞VEGF、MMP-9及TNF-α的表達(dá)

未轉(zhuǎn)染的A375細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可以檢測(cè)到大量VEGF和MMP-9的表達(dá)，分別為(698.75± 45.01) pg/ml和(12.75±1.71) ng/ml。而在轉(zhuǎn)染后的hckit/A375細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF和MMP-9的表達(dá)明顯降低，分別為(174.37±39.69) pg/ml和(7.75±2.63) ng/ml。加入rhSCF進(jìn)行干預(yù)后，兩者的表達(dá)均有明顯降低，各組間比較，P均＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的A375培養(yǎng)上清液中僅檢出極少量的TNF-α表達(dá)，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-kit的A375細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)出少量TNF-α。加入外源性rhSCF進(jìn)行培養(yǎng)后，TNF-α的表達(dá)明顯增加（表1）。

3 討論

3.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)c-kit的A375細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)使用Invitrogen公司生產(chǎn)的lipofectine 2000介導(dǎo)c-kit-WT pcDNA3.1 neo重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的A375細(xì)胞，雖然在本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)轉(zhuǎn)染率進(jìn)行直接檢測(cè)，但通過(guò)G418抗性篩選14 d后，我們獲得了多株陽(yáng)性克隆，這間接說(shuō)明通過(guò)該陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)取得了良好的轉(zhuǎn)染效果。而RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞中c-kit表達(dá)增加，更加證實(shí)了這一點(diǎn)。G418是一種氨基糖苷類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，在分子遺傳試驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。

研究表明，c-kit在黑素細(xì)胞的增殖和分化中起著重要的調(diào)節(jié)作用，且隨著黑素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，c-kit的表達(dá)逐漸減弱甚至缺失[4-6]。這一事實(shí)在體外培養(yǎng)的各類黑素瘤細(xì)胞中也得到了證實(shí)，大多數(shù)的人黑素瘤細(xì)胞株均不表達(dá)c-kit。本實(shí)驗(yàn)中選用的黑素瘤細(xì)胞A375具有較強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力，且在體外培養(yǎng)條件下無(wú)c-kit的表達(dá)。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn), A375 細(xì)胞中也有少量c-kit表達(dá)，這與國(guó)外學(xué)者的研究結(jié)果不同[6]。但本實(shí)驗(yàn)A375細(xì)胞中c-kit的濃度很低，這與我們研究所需的高表達(dá)c-kit的腫瘤細(xì)胞仍有本質(zhì)的區(qū)別，因此并不影響本研究結(jié)果。

目前，關(guān)于SCF/c-kit對(duì)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的作用研究主要是通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行的。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染獲得的細(xì)胞只能在數(shù)天內(nèi)進(jìn)行研究，無(wú)法對(duì)c-kit的長(zhǎng)期作用進(jìn)行研究。而我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)c-kit的A375細(xì)胞，并在后續(xù)的研究中證明該細(xì)胞傳10代后和反復(fù)凍融仍有明顯的c-kit表達(dá)。這在目前關(guān)于SCF/c-kit對(duì)黑素瘤的研究中罕見(jiàn)報(bào)道，也為我們建立研究rhSCF/c-kit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展中作用的細(xì)胞模型提供了可行性依據(jù)。

3.2 SCF/c-kit對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的影響

c-kit在正常黑素細(xì)胞及良性黑痣中的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性；而在轉(zhuǎn)移性黑素瘤的細(xì)胞中常常缺乏c-kit的表達(dá)，且c-kit的表達(dá)與腫瘤之間呈負(fù)相關(guān)[4-6]。本實(shí)驗(yàn)中所選用的黑素瘤細(xì)胞A375屬于惡性程度較高的黑素瘤細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)僅有少量的c-kit表達(dá)，這與其惡性程度相一致。而本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)c-kit的A375細(xì)胞株，c-kit的表達(dá)明顯增加，且該細(xì)胞的的生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在：①生長(zhǎng)曲線：我們發(fā)現(xiàn)hc-kit/ A375細(xì)胞的增殖較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A375受到抑制，且在細(xì)胞生長(zhǎng)至第5 d時(shí)，其抑制作用達(dá)到頂點(diǎn)。而給予外源性的SCF后細(xì)胞的增殖同樣受到抑制，且當(dāng)SCF與c-kit均增加時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用尤為明顯。②細(xì)胞周期：hc-kit/A375細(xì)胞的DNA合成期（S期）在細(xì)胞周期中所占比例明顯低于A375和A375-SCF細(xì)胞的S期，而hc-kit/A375-SCF組細(xì)胞的S期在細(xì)胞周期中所占的比例最低，而DNA合成期所占比例反映了細(xì)胞的增殖強(qiáng)弱。因此本研究結(jié)果提示hc-kit/A375和hc-kit/A375-SCF組細(xì)胞的增殖明顯弱于A375細(xì)胞。由此可見(jiàn)，單獨(dú)的SCF或c-kit均能抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖，這與國(guó)外學(xué)者的研究結(jié)果一致。本研究對(duì)SCF，c-kit單獨(dú)作用及兩者共同作用下黑素瘤細(xì)胞A375 的增殖進(jìn)行了研究和對(duì)比，使SCF及c-kit對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用有更全面的認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在兩者共同作用下，能更有效地抑制細(xì)胞的增殖。

表1 各組細(xì)胞VEGF、M M P-9和TN F-α的表達(dá)比較 （±s）

表1 各組細(xì)胞VEGF、M M P-9和TN F-α的表達(dá)比較 （±s）

注：與A375細(xì)胞組比較，*P＜0.05；組間比較，#P＜0.05

組 別 VEGF（pg/ml）MMP-9 (ng/ml) TNF-α（pg/ml）A375細(xì)胞組698.75±45.0112.75±1.71112.00±20.45 A375-SCF組483.89±24.75*#10.25±3.37*#64.68±20.24*#hc-kit/A375組 174.37±79.38*#7.75±2.63*#17.35±2.06*#hc-kit/A375-SCF組126.15±14.79*#5.43±1.22*#11.07±3.24*#

SCF/c-kit抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚不清楚，可能與下列因素有關(guān)：①SCF可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶C(PKC)的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制c-kit表達(dá)陽(yáng)性的黑素瘤細(xì)胞增殖。②SCF/c-kit信號(hào)可能負(fù)責(zé)控制黑素瘤細(xì)胞黏連分子（MCAM） 的合成。MCAM 在黑素瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào)通常伴有腫瘤細(xì)胞增殖加速和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞丟失 c-kit受體后，MCAM便得以表達(dá)，進(jìn)而使黑素瘤發(fā)生惡變、增生[7]。③SCF通過(guò)下調(diào)與黑素瘤生長(zhǎng)有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-7、IL-8、IL-10、GM-CSF及TGF-β等，從而抑制黑素瘤的增生速度[8]，這一點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SCF/c-kit可能通過(guò)抑制細(xì)胞的DNA合成抑制細(xì)胞的增殖。

3.3 SCF/c-kit對(duì)黑素瘤細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡異常在大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)病學(xué)上具有重要地位[9]。大量研究表明惡性黑素瘤與其他惡性腫瘤相比，其腫瘤細(xì)胞的自發(fā)凋亡水平較低，提示其凋亡不足與其侵襲、轉(zhuǎn)移及治療耐受性相關(guān)[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，增加A375細(xì)胞c-kit的表達(dá)后，細(xì)胞的凋亡率明顯增加。在SCF與c-kit的共同作用下，能更有效地促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，這與國(guó)外學(xué)者的研究結(jié)果一致[11]。

細(xì)胞凋亡功能的失調(diào)在影響黑素瘤的生物學(xué)行為上起重要作用。而大多數(shù)凋亡信號(hào)途徑依賴于TNF-α。TNF-α是由炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，通過(guò)與細(xì)胞膜表面TNF-α受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，引起多種正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的凋亡[12,13]。在本實(shí)驗(yàn)中，在c-kit及SCF的作用下， A375細(xì)胞分泌的TNF-α增加，這可能是SCF/c-kit促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

3.4 SCF/c-kit對(duì)黑素瘤細(xì)胞VEGF和MMP-9表達(dá)的影響

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素參與調(diào)控的漫長(zhǎng)過(guò)程，在這過(guò)程中惡性腫瘤必須依靠機(jī)體的血液供應(yīng)進(jìn)行生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）引起轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。在這個(gè)過(guò)程中VEGF[14]和MMPs起著重要作用[15]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在惡性黑素瘤中的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的增加而增加，且在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)中起重要的作用[16,17]。在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，ECM是癌細(xì)胞脫落游走的主要障礙。惡性腫瘤的浸潤(rùn)很大程度上依賴于腫瘤細(xì)胞外周基質(zhì)成分的降解，研究表明 MMPs在這一過(guò)程中起關(guān)鍵作用。MMPs是一組具有高度同源性的能降解基膜等基質(zhì)成分的水解酶，MMPs在很多惡性腫瘤中均有較高水平的表達(dá)，發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)等作用，并與許多腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。其中，MMP-9因能降解基膜和多種細(xì)胞外基質(zhì)成分而倍受關(guān)注。同樣MMP-9在惡性黑素瘤中的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移性侵襲成正相關(guān)。

目前關(guān)于SCF/c-kit對(duì)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移抑制作用機(jī)制的研究尚不多，有研究證實(shí)SCF/c-kit可能通過(guò)抑制MCAM抑制黑素瘤轉(zhuǎn)移[7]。但腫瘤的轉(zhuǎn)移和多種因素有關(guān)，其中腫瘤細(xì)胞通過(guò)自分泌或旁分泌的形式分泌細(xì)胞因子起著重要的作用。本研究顯示，黑素瘤細(xì)胞A375中VEGF和MMP-9的表達(dá)明顯高于穩(wěn)定表達(dá)c-kit的A375細(xì)胞，同時(shí)在SCF干預(yù)后，兩者的表達(dá)均明顯降低。這一結(jié)果提示SCF/ c-kit可能通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF和MMP-9的表達(dá)，抑制黑素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

[1] Martin FH, Suggs SV, Langley KE, et a1. Primary structure and functional expression of rat and human stem cell factor DNAs [J]. Cell, 1990, 63(1):203-211.

[2] Anderson DM, Lyman SD, Baird A, et a1. Molecular cloningof mast cell growth factor, a hematopoietin that is active in both membrane bound and soluble forms [J]. Cell, 1990, 63(1):235-243．

[3] Zsebo KM, Williams DA, Geissler EN, et a1. Stem cell factor is encoded at the Sl locus of the mouse and is the ligand for the c-kit tyrosine kinase receptor [J]. Cell, 1990, 63(1):213-224.

[4] Stefanou D, Batistatou A, Zioga A, et al. Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and C-KIT in cutaneous melanocytic lesions [J]. Int J Surg Pathol, 2004, 12(2):133-138．

[5] Potti A, Moazzam N, Langness E, et al. Immunohistochemical determination of HER-2/neu, c-Kit (CD117), and vascular endothelial growth factor (VEGF) overexpression in malignant melanoma [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2004, 130 (2):80-86.

[6] Guerriere-Kovach PM, Hunt EL, Patterson JW, et al. Primary melanoma of the skin and cutaneous melanomatous metastases: comparative histologic features and immunophenotypes [J]. Am J Clin Pathol, 2004, 122 (1):70-77.

[7] Karlen S, Braathen LR. Regulation of the melanoma cell adhesion molecule gene in melanoma: modulation of mRNA synthesis by cyclic adenosine monophosphate, phorbol ester, and stem cell fFactor/c-kKit signaling [J]. J Invest Dermatol, 1999, 113(5):711-719．

[8] Francesca P, Gianni G, Benedetta S, et al. Stem cell factor affects tumour progression markers in metastatic melanoma cells [J]. Clin Exp Metastasis, 2006, 23(3-4):177-186．

[9] Favrot M, Coll JL, Louis N, et al. Cell death and cancer: replacement of apoptotic genes and inactivation of death suppressor genes in therapy [J]. Gene Ther, 1998, 5(6):728-739.

[10] Soengas MS, Lowe SW. Apoptosis and melanoma chemoresistance [J]. Oncogene, 2003, 22(20):3138-3151.

[11] Huang S, Luca M, Gutman M, et al. Enforced c-KIT expression renders highly metastatic human melanoma cells susceptible to stem cell factor-induced apoptosis and inhibits their tumorigenic and metastatic potential [J]. Oncogene, 1996, 13(11):2339-2347.

[12] Chopra DP, Menard RE, Januszewski J, et al. TNF-alphamediated apoptosis in normal human prostate epithelial cells and tumor cell lines [J]. Cancer Lett, 2004, 203(2):145-154.

[13] Fukui T, Matsui K, Kato H, et al. Significance of apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha and/or interferon-gamma against human gastric cancer cell lines and the role of the p53 gene [J]. Surg Today, 2003, 33(11):847-853.

[14] Lee JC, Chow NH, Wang ST, et a1. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in colorectal cancer patients [J]. Eur J Cancer, 2000, 36(6):748-753.

[15] 孔靈玲, 楊建文, 崔文. 基質(zhì)金屬蛋白酶及其腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展 [J]. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 26(1):64-66.

[16] Salven P, Heikkil? P, Joensuu H. Enhanced expression of vascular endothelial growth factor in metastatic melanoma [J]. Br J Cancer, 1997, 76(7):930-934.

[17] Claffey KP, Brown LF, del Aguila LF, et al．Expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor by melanoma cells increases tumor growth, angiogenesis, and experimental metastasis [J]. Cancer Res, 1996, 56(1):172-181.

The effect of SCF and its receptor c-kit on A375 cell proliferation and apoptosis in vivo

WU Dong-mei，CEN Ying

Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610031, China

ObjectiveTo establish malignant melanoma cells A375 which stably expressing the human stem cell factor receptor c-kit and observe the effect of exogenous SCF/c-kit on cell growth and apoptosis.MethodsBy liposomal transfection technology, cell line which stably expressing c-kit receptor(hc-kit/A375) was established. Then exogenous SCF was given to A375 cells and hc-kit/A375 cells, all the cells were divided into four groups: A375 group, A375-SCF group, hc-kit/A375 group and hc-kit/A375-SCF group, then the cell growth and apoptosis were observed by MTT method and fl ow cytometry. ELISA and immunohistochemistry staining were used to confi rm the effect of SCF/c-kit on expression of VEGF, MMP-9, TNF-α.ResultThe recombinant plasmid c-kit-pcDNA3.1 neo was successfully transfected into melanoma cells, and the cell line hc-kit/A375 which stably expressing c-kit was established. C-kit expression was signifi cantly increased in the cell line hc-kit/A375. After exogenous SCF was given, the cell growth was restrained, especially in the fifth day; cell apoptosis rate significantly increased; S phase ratio was reduced, and the hc-kit/A375-SCF group was especially apparent. ELISA analysis and immunohistochemitry staining of the cells confi rmed that SCF/c-kit can reduce the expression of VEGF and MMP-9 of A375 cell, contrarily the expression of TNF-a increased.ConclusionThrough the liposome transfection and G418 selection we successfully established A375 cells which stably expressing c-kit; increased expression of SCF/c-kit in A375 cell can depress the cell growth and enhance the cell apoptosis by increasing the expression of TNF-α and reducing the expression of VEGF, MMP-9.

Malignant melanoma，metastasis；Stem cell factor；Receptor c-kit；Stable transfection；Cell，A375

R393；R739.5

A

1674-1293(2012)04-0193-06

2012-05-05

2012-06-26）

（本文編輯 耿建麗）

610031 成都，四川省人民醫(yī)院皮膚外科（吳冬梅）；四川大學(xué)華西醫(yī)院燒傷整形科（岑瑛）

吳冬梅，博士，主治醫(yī)師，研究方向：皮膚腫瘤的診斷和基因治療、瘢痕的綜合治療，E-mail: sunsearch@163.com

岑瑛，E-mail: 191376086@qq.com