毛細管電泳法測定動物肝臟中的谷胱甘肽

劉開敏，王文坤，吳麗云

（1. 湄洲灣職業(yè)技術學院，福建 莆田 351254； 2. 南京軍區(qū)莆田九五醫(yī)院，福建 莆田 351100）

毛細管電泳法測定動物肝臟中的谷胱甘肽

劉開敏1，王文坤2，吳麗云1

（1. 湄洲灣職業(yè)技術學院，福建 莆田 351254； 2. 南京軍區(qū)莆田九五醫(yī)院，福建 莆田 351100）

建立了以0.07 mol·L-1Na2HPO4-0.07 mol·L-1KH2PO4的混合體系（pH7.38）為運行緩沖液，在230 nm紫外檢測波長下，用毛細管電泳法測定雞和豬肝臟中谷胱甘肽（GSH）的含量。結(jié)果表明：在最佳電泳條件下，GSH在5.0×10-6～1.0×10-3mol·L-1的范圍內(nèi)有良好的線性關系，r=0.999 7，最低檢出限為1.6×10-6mol·L-1；加標回收率在94.81%～99.02%之間，RSD在1.56%～3.25%之間；該方法操作簡便，快速，可靠性高，可用于動物肝臟中的谷胱甘肽含量的測定。

谷胱甘肽；毛細管電泳法；動物肝臟；磷酸鹽緩沖液

谷胱甘肽廣泛存在于動、植物中，在面包酵母、小麥胚芽和動物肝臟中的含量極高，以還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種形式存在。GSH可以清除新陳代謝產(chǎn)生的自由基，起到強有力的保護作用，具有保護肝臟、抗病毒、解毒及抗腫瘤作用，在細胞的多種基本代謝中起重要作用，GSH在食品、保健品等領域也有較大的應用前景[1]。目前，測定生物樣品中 GSH的含量方法有高效液相色譜法[2,3]、分光光度法[4]、熒光分光光度法[5]、化學發(fā)光法[6]等。本文建立了具有高效、快速、準確、精密度好的毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis，簡稱CE）測定了動物肝臟中的谷胱甘肽。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細管電泳系統(tǒng)（WynSep，含數(shù)據(jù)處理軟件），石英毛細管柱（華瑞博遠），UP2200HE超聲波清洗器（南京壘君達超聲電子設備有限公司），離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司），pHS-3C型精密酸度計（上海精科儀器有限公司）。GSH標準品（純度≥99%）、磺基水楊酸（SS）、磷酸二氫鉀和酸酸氫二鈉（分析純），實驗用水為超純水。

1.2 GSH標準儲備液的制備

精確稱量GSH標準品0.307 3 g，加少量超純水溶解，轉(zhuǎn)移到100.0 mL容量瓶中，定容，將溶液通氮氣除去氧氣，放在 0℃冰箱內(nèi)保存，此溶液的濃度為1.00×10-3mol·L-1。

1.3 樣品溶液制備

取新鮮動物肝臟（雞和豬）若干，洗凈并搗成均漿，混勻，準確稱取1.00 g置于燒杯中，加入適量的磺基水楊酸(SS)，使其pH在3.0～4.0之間，可有效防止GSH的氧化，加入少量超純水，離心（3 000 r·min-1），上清液轉(zhuǎn)移到1 000 mL容量瓶中，超純水定容。再用微孔濾膜濾得清液，并通氮氣除去氧氣，放在0 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.4 磷酸鹽緩沖液（簡稱PBS）的配制

分別配制 0.07 mol·L-1Na2HPO4和 0.07 mol·L-1KH2PO4溶液，按不同體積比混合成磷酸鹽緩沖液。

1.5 實驗方法

石英毛細管柱先用0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液洗6 min，再用超純水洗滌10 min，最后用PBS緩沖液洗滌15 min。在最佳CE條件（如表1所示）下進行電泳分析，得到GSH標準品和樣品（雞和豬肝臟）的毛細管電泳圖，峰形對稱良好，與樣品中的其它組分可以達到有效分離，結(jié)果見圖1。

表1 最佳電泳條件Table 1 The best condition of CE

圖1 GSH標準品(a)與雞肝臟(b)的毛細管電泳譜圖Fig.1 Electropherogram of GSH standard sample (a) and sample (b:chicken liver)

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 緩沖液的選擇

分別比較磷酸氫二鈉–檸檬酸、巴比妥鈉–鹽酸、硼酸–硼砂、磷酸二氫鉀–氫氧化鈉、磷酸鹽(PBS)五種緩沖液對測試的影響，實驗表明，采用磷酸鹽（0.07 mol·L-1Na2HPO4和0.07 mol·L-1KH2PO4）緩沖液（體積比為4∶1，pH7.38），實驗靈敏度最高。

2.2 分離電壓的選擇

分離電壓的大小直接影響毛細管中的場強，遷移時間，柱效和焦耳熱大小等。本文考察了電壓范圍在15～35 kV之間對GSH遷移行為的影響，結(jié)果見圖 2。電壓低時，遷移時間延長，電壓太高，將導致分離度與柱效下降，經(jīng)綜合比較后，選擇22 kV為最佳電壓。

2.3 線性關系與檢測限

在優(yōu)化的實驗條件下，GSH標準液C在5.0× 10-6～1.0×10-3mol·L-1的范圍內(nèi)與峰面積A有良好的線性關系，回歸方程為 A=6.89×107·C－41.91，相關系數(shù)r=0.999 7，檢出限為1.6×10-6mol·L-1，下限重復測定7次，測得遷移時間，峰面積和峰高的相對標準偏差（RSD）均小于2.5%。

2.4 樣品分析

在最佳電泳條件下，按實驗方法1.5測定由1.3方法制備的雞和豬肝臟樣品溶液中 GSH的平均含量及回收率，結(jié)果列于表2。

采用紫外分光光度法[4]測定上述雞肝和豬肝樣品中 GSH含量的作對比，得到雞肝和豬肝樣品中GSH含量分別為2.62 mg·g-1和3.10 mg·g-1。

圖2 電壓對GSH遷移行為的影響Fig.2 Effect of applied voltage on the separation of GSH

3 結(jié) 論

（1）在樣品的預處理中，加入磺基水楊酸使溶液pH在3.0～4.0之間和通入氮氣除氧氣的目的是防止GSH的氧化；采用PBS磷酸鹽緩沖液（pH7.38），儀器基線較為平直，背景噪聲最小，靈敏度最高。（2）由表2可以看出，本法測定動物肝臟中GSH含量，加標回收率在94.81%～99.02%之間，RSD在1.56%～3.25%之間，具有較好的精密度和準確度， 適用于其它動物肝臟和水果中GSH含量的測定。

表2 樣品中GSH的測定結(jié)果Table 2 Determination results of GSH in sample

（3）本法與紫外分光光度法測定雞肝和豬肝樣品中GSH含量作對比，測得含量基本一致，且該方法更快速、簡便、精度優(yōu)于紫外分光光度法。

［1］ 范崇東，王淼,等．谷胱甘肽測定方法研究進展[J].生物技術，2004，14(1)：68-70.

［2］ 杜小莉,等．HPLC測定還原型谷胱甘肽的血漿濃度[J].中國醫(yī)藥雜志，2005，40(6)：454-457.

［3］ 王愛月，解魁,等．高效液相色譜法測定保健食品中谷胱甘肽含量的方法研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17(7)：1181-1182.

［4］ 翟文慧，王愛月．紫外分光光度法測定保健食品中谷胱甘肽[J].預防醫(yī)學論壇，2005，11(5)：560-561.

［5］ 張靜，吉宏武,等．熒光分光光度法測定海洋生物中的谷胱甘肽[J].湛江海洋大學學報，2005，25(4)：32-34.

［6］ 齊瑩瑩，吳瑩,等．電化學發(fā)光猝滅法測定谷胱甘肽[J].光譜學與光譜分析，2005，25(2)：195-196.

Determination of Glutathione in Animal Livers by the Capillary Electrophoresis

LIU Kai-min1，WANG Wen-kun2，WU Li-yung1
（1. Meizhouwan Vocational Technical College,Fujian Putian 351254，China；2. Nanjing Military Command Putian No. 95 Hospital, Fujian Putian 351100，China）

A method for the determination of glutathione(GSH) in chicken and pig livers by the capillary electrophoresis with UV detection(230 nm) was developed. Determination of GSH was carried out by using the phosphate buffer system(PBS) containing 0.07 mol·L-1Na2HPO4–0.07 mol·L-1KH2PO4(pH7.38).The quantitative analysis was performed with external standard under the optimal conditions．The results show that the linear response range of this method is from 5.0×10-6mol·L-1to 1.0×10-3mol·L-1with r=0.999 7, and the detection limit is 1.6×10-6mol·L-1.The recovery rate is in the range of 94.81% ～ 99.02%, and the RSD is in the range of 1.56% ～ 3.25%.The method is simple, rapid, accurate and stable. The method can be used for determination of GSH in animal livers.

Glutathione；Capillary electrophoresis；Animal live；Phosphate buffer

O 658

A

1671-0460（2012）09-1003-03

2012-04-06

劉開敏(1973-)，男，福建莆田人，講師，碩士，2008年畢業(yè)于福州大學化學化工學院分析化學專業(yè)，研究方向：從事工業(yè)分析和化學分析等技術工作。E-mail：13860907185@163.com