豬毛菜液泡膜SsNHX1基因的克隆及功能驗證

張春玉，宋 凱，高立宏，，郭立泉，李望豐，劉立俠

（1.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林 長春 130033；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024；3.長春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130032）

土壤鹽漬化是威脅農(nóng)作物生產(chǎn)的非生物脅迫因素之一［1］.在鹽脅迫條件下，高等植物主要是通過Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)Na＋外排，抗拒鹽離子毒害［2－4］.隨著人們相繼在多種植物及酵母的生物膜上觀察到Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白的活性［5－6］，有關(guān)質(zhì)膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白的研究受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注.高等植物的一些鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)的分子機制與酵母細胞具有相似性，因此，利用酵母系統(tǒng)來分離鑒定功能保守的高等植物基因被認為是一條行之有效的快捷途徑［7－9］.

近年來，關(guān)于植物中Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白的研究已有很多報道，但是關(guān)于鹽地植物豬毛菜（Salsola collina Pall）Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的研究報道卻很少.本研究首次成功地從鹽生植物——豬毛菜中克隆了液泡膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SsNHX1，并對其耐鹽能力進行了驗證，這對挖掘鹽地植物優(yōu)質(zhì)耐鹽基因資源具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

豬毛菜采自于吉林省西部鹽堿地區(qū).酵母表達載體pPIC9和菌株GS115購于Invitrogen公司；克隆載體pMD18－T購于大連寶生物公司TaKaRa公司；DNA限制性內(nèi)切酶，Taq酶，T4DNA連接酶，RNA PCR kit，DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA Marker購自大連寶生物公司.PCR引物合成和基因測序均由上海生工生物公司完成.

1.2 實驗方法

1.2.1 SsNHX1基因編碼區(qū)克隆

根據(jù)SsNHX1基因全序列設(shè)計引物I（含Bam HI酶切位點）和J（含Eco RI酶切位點），序列如下：

提取豬毛菜葉片RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA，再進行PCR擴增，獲得了SsNHX1基因的編碼區(qū)序列，將之連接在pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進行鑒定及測序.將含有BamHI和EcoRI酶切位點的pMD18－T命名為pMD18－T1.

1.2.2 酵母重組表達載體pPIC－SsNHX1的構(gòu)建

將含有目的基因的pMD18－T1載體和表達載體pPIC9用Bam HI和Eco RI分別進行雙酶切；試劑盒回收目的片段和載體片段，連接2h；取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，氨芐青霉平板篩選轉(zhuǎn)化子；用Bam HI和Eco RI酶切驗證重組質(zhì)粒，命名為pPIC－SsNHX1.

1.2.3 重組酵母轉(zhuǎn)化子的獲得

（1）重組載體的線性化和酵母的轉(zhuǎn)化

酶切表達載體pPIC－SsNHX1，凝膠回收目的片段；取20μL目的片段，加入100μL酵母感受態(tài)細胞，將二者混勻后，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)環(huán)，冰上放置10min，放入基因?qū)雰x中（寧波，新芝JY－2000－1B），調(diào)節(jié)其電壓為1500V，電容為50μF，電阻為200Ω.電轉(zhuǎn)化酵母細胞7.2ms，立即加入700μL預(yù)冷的1mol／L山梨醇，混勻，混合物吸出至離心管中，30℃緩慢搖動1h；分別取100，200μL涂MD平板，充分吸干水分后，封口于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，2～3d后觀察轉(zhuǎn)化子生長情況.同時，取未轉(zhuǎn)化的酵母感受態(tài)細胞涂MD平板作負對照.

（2）重組酵母轉(zhuǎn)化子的表型鑒定

取培養(yǎng)在MM和MD培養(yǎng)基中（2～3d）的酵母轉(zhuǎn)化子（直徑3nm）觀察表型大?。?－10］.

（3）重組酵母轉(zhuǎn)化子的分子生物學(xué)鑒定

酵母重組子液體MD中30℃過夜培養(yǎng)，提取酵母基因組DNA，以引物1做PCR檢測.

（4）重組酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽實驗

將重組酵母轉(zhuǎn)化子和空白酵母共同轉(zhuǎn)到含有0.5mol／L NaCl的YPD固體平板上，30℃培養(yǎng)2～3d.計算菌落的直徑和生長速率.

2 結(jié)果和分析

2.1 酵母表達載體pPIC－SsNHX1的構(gòu)建

我們從豬毛菜基因組中克隆了1700bp的SsNHX1基因編碼區(qū)全序列（兩側(cè)有Eco RI和Bam HI酶切位點），如圖1－A所示.將其連接到pMD18－T載體后進行測序，連接結(jié)果見圖1－B.用Bam HI和Eco RI將SsNHX1基因卸載下來，回收后連接到酵母表達載體pPIC9的Bam HI和Eco RI位點中，同時將酵母表達載體pPIC9的信號肽替換掉，結(jié)果見1－C.酵母表達載體pPIC－SsNHX1示意圖見圖1－D.

圖1 酵母表達載體pPIC－SsNHX1構(gòu)建

2.2 重組酵母轉(zhuǎn)化子pPIC9－SsNHX1的獲得

用BglⅡ酶切重組的畢赤酵母表達載體pPIC9－SsNHX1，使其切線性化，利用電轉(zhuǎn)法將目的基因轉(zhuǎn)入到酵母基因組中獲得轉(zhuǎn)化子.由于轉(zhuǎn)化子中有組氨酸基因，而野生型的畢赤酵母GS115為組氨酸基因缺陷型，所以轉(zhuǎn)化子在不含組氨酸的選擇培養(yǎng)基MD上能正常生長.3d后挑取8個酵母單克隆菌落，分別挑至MM和MD培養(yǎng)基進行對比培養(yǎng)，鑒定表型.如果二者酵母菌生長相似、菌落大小差不多，說明目的片段為單點插入整合，表型為His＋Mut＋；如果在MD培養(yǎng)基上生長的菌落明顯比MM培養(yǎng)基上的大，說明基因片段為雙點替換整合，表型為His＋Muts.我們挑取的8個酵母轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過MM和MD培養(yǎng)基對比培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，從表型上看絕大部分是His＋Mut＋型，只有第4個菌落為His＋Muts型，結(jié)果如圖2所示.

圖2 豬毛菜SsNHX1酵母轉(zhuǎn)化子在MD和MM培養(yǎng)基上的生長表型鑒定

2.3 酵母轉(zhuǎn)化子的分子生物學(xué)鑒定

參照畢赤酵母表達手冊方法提取上述7個His＋Mut＋型酵母轉(zhuǎn)化子的總DNA，利用PCR擴增進行檢測，方法和擴增程序如前所述，結(jié)果如圖3所示.由圖3可見，7份酵母轉(zhuǎn)化子均為陽性，此結(jié)果表明外源目的基因已經(jīng)成功整合到酵母GS115基因組中.

圖3 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果

圖4 酵母轉(zhuǎn)化子在鹽脅迫條件下的生長情況

2.4 重組酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽實驗

為了驗證豬毛菜SsNHX1基因在酵母中是否能發(fā)揮耐鹽功能，30℃條件下，將4個轉(zhuǎn)化子和空白對照酵母培養(yǎng)在含有0.5mol／L NaCl的YPD固體平板中，培養(yǎng)2～3d后觀察，結(jié)果如圖4所示.從圖4我們可以看出，重組酵母轉(zhuǎn)化子的生長速率和菌落直徑均明顯高于對照，這初步表明豬毛菜SsNHX1基因能夠有效地提高酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽能力.

3 結(jié)論

本研究首次從鹽生植物豬毛菜中克隆了液泡膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SsNHX1（EU073422），并以酵母為表達載體，獲得了陽性轉(zhuǎn)化子.耐鹽實驗表明整合有豬毛菜SsNHX1基因的酵母在含有0.5mol／L NaCl的培養(yǎng)基中，與對照相比有更高的生長速率.這與濱藜液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（AgNHX1）、棉花液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（GhNHX1）和小麥液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（TaNHX1）在酵母中表達的研究結(jié)果相似［7，9，11］.這充分證明了豬毛菜液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因在真核生物酵母的耐鹽脅迫中起到了重要的作用.

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