白術(shù)多糖WAM-1結(jié)構(gòu)的色譜分析和原子力顯微鏡觀察

伍樂(lè)芹，姜紹芬，張 靜

陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710062

白術(shù)多糖WAM-1結(jié)構(gòu)的色譜分析和原子力顯微鏡觀察

伍樂(lè)芹，姜紹芬，張 靜*

陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710062

通過(guò)熱水浸提法從草本植物白術(shù)根莖提取的水溶性粗多糖，經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離和Sephadex G-200凝膠過(guò)濾柱層析純化，得到組分WAM-1。采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)WAM-1的純度，氣相色譜(GC)對(duì)其單糖組分進(jìn)行分析，原子力顯微鏡(AFM)對(duì)其分子外貌進(jìn)行觀測(cè)。結(jié)果顯示:WAM-1為均一多糖，由葡萄糖和半乳糖以3.01∶1摩爾比構(gòu)成;在不同濃度溶液條件下，WAM-1分子以不同形態(tài)存在，多糖溶液的濃度對(duì)WAM-1的分子鏈構(gòu)象及鏈間相互作用形式產(chǎn)生影響，推測(cè)可能與WAM-1分子內(nèi)、分子間的氫鍵締合作用有關(guān)。多糖濃度為10 μg/mL時(shí)，可清晰的觀察到WAM-1是以剛性鏈狀形態(tài)存在，且具有多分支結(jié)構(gòu)。

白術(shù)多糖;分離純化;原子力顯微鏡

白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz)，別名云術(shù)、山姜、冬白術(shù)等，為菊科多年生草本植物。白術(shù)是我國(guó)常用的中藥材之一，在中醫(yī)臨床上主要用于治療脾胃虛弱、汗出、胎動(dòng)不安等，白術(shù)的干燥根莖，性溫味甘，具有健脾補(bǔ)胃、益氣生血、燥濕利水等功效［1］。白術(shù)含揮發(fā)油、內(nèi)酯、多糖等成分，其中白術(shù)多糖經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有抗氧化、提高免疫力、降血糖、抗腫瘤等生物活性［2］。白術(shù)多糖是否具有生物活性主要取決于多糖的物理性質(zhì)、一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型等［3］，因此，對(duì)白術(shù)多糖的構(gòu)象研究具有重要意義。

原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)是通過(guò)微小探針與樣品表面之間的相互作用來(lái)獲得各種材料表面結(jié)構(gòu)形貌信息的儀器。具有原子級(jí)高分辨率(縱向分辨率:0.1 nm)，可以在大氣和液體環(huán)境下對(duì)各種材料和樣品的納米微區(qū)域進(jìn)行觀測(cè)?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物、化工、食品和醫(yī)藥研究中多種大分子鏈構(gòu)象的分析研究［4］。AFM作為探索納米級(jí)微觀世界的有效手段，已經(jīng)越來(lái)越多的被應(yīng)用于多糖構(gòu)象研究中［5，6］。本文采用DEAE-52纖維素層析柱和Sephadex G-200凝膠色譜對(duì)白術(shù)水提粗多糖進(jìn)行分離純化，獲得均多糖WAM-1，并采用GC和AFM研究其單糖組分及分子形貌，同時(shí)探討濃度對(duì)WAM-1多糖微觀形貌的影響，為白術(shù)多糖的生物活性與構(gòu)象關(guān)系的研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白術(shù)，產(chǎn)地浙江，購(gòu)于西安市中藥材市場(chǎng)。

DEAE-52纖維素(Solarbio公司);Sephadex G-200(Pharmacia公司);D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖(sigma公司);其它試劑均為AR級(jí)。

Christ Alpha-4真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó) Marin Christ公司);SPM-9500J3型原子力顯微鏡(日本島津公司);氣相色譜儀(Agilent公司);高效液相色譜儀(Waters公司)。

1.2 白術(shù)多糖的提取、分離和純化

白術(shù)粗多糖AM的提取方法參照文獻(xiàn)［7］。取AM(100 mg)溶于蒸餾水(10 mL)，離心，上清液經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析初步分離，依次用蒸餾水、0.1、0.2 mol/L NaCl及0.3 mol/L NaCl溶液洗脫，流速為0.6 mL/min，DBS-100收集器進(jìn)行收集，每管8 mL，苯酚-硫酸法檢測(cè)，收集各組分洗脫液，減壓濃縮后冷凍干燥。主峰多糖組分為蒸餾水洗脫所得組分，命名為WAM。取WAM(30 mg)溶于蒸餾水(5 mL)，離心，上清液再經(jīng)Sephadex G-200凝膠過(guò)濾柱層析純化，蒸餾水為洗脫液，流速為0.3 mL/ min，每管收集3 mL，苯酚-硫酸法檢測(cè)，收集洗脫液，冷凍干燥得到多糖WAM-1。

1.3 WAM-1的純度鑒定

采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)WAM-1多糖進(jìn)行純度鑒定。稱(chēng)取WAM-1適量，配制1 mg/mL濃度多糖溶液，進(jìn)行HPLC分析。色譜條件:Waters1525高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Shodex Ohpak SB-804 HQ，流動(dòng)相為超純水，流速為0.8 mL/min，Wtaers2410示差折光檢測(cè)器，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 WAM-1的單糖組分分析

稱(chēng)取WAM-1(5 mg)置于具塞試管中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)，110℃水解4 h，取出后加入少量甲醇進(jìn)行減壓濃縮，重復(fù)3次，以除盡TFA，得水解產(chǎn)物。在水解產(chǎn)物加入0.5 mL吡啶，10 mg鹽酸羥胺，2 mg肌醇六乙酰酯(內(nèi)標(biāo))，置于90℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，再加入0.5 mL無(wú)水乙酸酐，于90℃水浴繼續(xù)反應(yīng)30 min，得糖腈乙酸酯衍生物［8］，之后進(jìn)行GC色譜分析;以標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖腈乙酸酯衍生物作對(duì)照。色譜條件:程序升溫，150～190℃，升溫速率7.0℃/min，190～250℃，升溫速率15℃/min;進(jìn)樣溫度為280℃;檢測(cè)器溫度為260℃。

1.5WAM-1的AFM觀測(cè)

將干燥的樣品用去離子水溶解后，配成50、25和10 μg/mL溶液濃度梯度，置于磁力攪拌器持續(xù)攪拌4 h后，采用傳統(tǒng)滴加沉積法將樣品溶液滴在新剝離的云母表面［9］，室溫干燥，放置于AFM上對(duì)其分子形態(tài)進(jìn)行掃描觀測(cè)。圖像均在contact模式下獲得，探針為Si3N4(微懸臂長(zhǎng):200 μm，彈性系數(shù)0.12 N/m)，原子力顯微鏡圖像的形態(tài)學(xué)特征(如高度、寬度等)均采用原子力顯微鏡附帶的軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 WAM-1的純度鑒定

在WAM-1的HPLC譜圖中，該多糖的吸收峰為單一狹窄對(duì)稱(chēng)峰，表明WAM-1為均多糖。

圖1 WAM-1的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of WAM-1

2.2 WAM-1的單糖組分分析

7種標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖及保留時(shí)間(RT)見(jiàn)圖2和表1。由圖2可見(jiàn)，各峰分離較好，基本無(wú)干擾現(xiàn)象。在WAM-1的糖腈乙酸酯的氣相色譜(圖3)中出現(xiàn)3個(gè)峰，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜比照分析可知，1號(hào)峰為葡萄糖，2號(hào)峰為半乳糖，3號(hào)峰是內(nèi)標(biāo)峰。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的參比，由公式R1/2=f×(A1/A2)(其中f為校正因子，A為峰面積)計(jì)算得出，在WAM-1中葡萄糖和半乳糖的摩爾比為3.01∶1，說(shuō)明WAM-1是一種由葡萄糖和半乳糖兩種單糖以3.01∶1的摩爾比例構(gòu)成的雜多糖。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖Fig.2 GC of mixed standard Monosaccharides

表1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間Table 1 Retention time of standard monosaccharide

圖3 WAM-1的氣相色譜圖Fig.3 GC of WAM-1

2.3 WAM-1的AFM觀察結(jié)果

圖4a和4b分別為50 μg/mL的WAM-1不同放大倍數(shù)的原子力顯微鏡圖，可以看到，在疏水云母表面，WAM-1呈片狀，球狀等不規(guī)則形態(tài)，即使提高放大倍率，也沒(méi)有清晰細(xì)節(jié)，不能獲得多糖聚集體的微觀形貌特征，這可能是由于多糖濃度過(guò)大，羥基數(shù)目多，分子間的氫鍵締合作用強(qiáng)，多糖聚合較緊密，導(dǎo)致無(wú)法觀察多糖真實(shí)形態(tài)。

圖5a和5b分別為25 μg/mL的WAM-1不同放大倍數(shù)的原子力顯微鏡圖，由圖可見(jiàn)，WAM-1仍呈片狀，提高放大倍率后，但可以清楚的看見(jiàn)片狀中存在許多亮顆粒。通過(guò)和圖4比較，可以推測(cè)，多糖濃度降低，羥基數(shù)目減少，多糖分子間的締合作用減弱，有效的降低多糖的聚合程度，有利于觀察多糖的真實(shí)形態(tài)。

圖6a和6b分別為10 μg/mL的WAM-1不同放大倍數(shù)的原子力顯微鏡圖，圖6c為圖6b的三維形態(tài)。從圖中可以清晰地看到WAM-1以剛性分子鏈形態(tài)存在，且具有分支結(jié)構(gòu)。利用原子力顯微鏡附帶軟件測(cè)得其單鏈高度在0.88～2.10 nm，寬度在51～110 nm范圍，寬度可能是由探針的加寬效應(yīng)造成的。

圖6 WAM-1(10 μg/mL)的原子力顯微鏡圖Fig.6 AFM images of WAM-1(10 μg/mL)

3 討論

不同濃度WAM-1的原子力顯微鏡之間的區(qū)別表明，WAM-1分子間的相互作用和聚集度隨著多糖濃度的增加而增大。當(dāng)溶液中WAM-1的濃度較小時(shí)，多糖分子間的相互作用較小，分子比較分散，當(dāng)多糖濃度增大至一定程度時(shí)，多糖分子間相互作用增強(qiáng)，形成聚集態(tài)。

圖4和圖5中，觀察到WAM-1多糖的存在形態(tài)為大小不一，形態(tài)各異的聚集體。而圖6中，可以看到清晰穩(wěn)定的WAM-1多糖多分支的分子鏈結(jié)構(gòu)。多糖的結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)等，要想得到更多的結(jié)構(gòu)信息要配合使用其它的儀器分析方法和物理化學(xué)方法，如部分酸水解、高碘酸氧化、史密斯降解、NMR、GC-MS等，這樣就能得出WAM-1主鏈及側(cè)鏈的組成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在采用原子力顯微鏡觀察多糖的微觀形貌時(shí)，應(yīng)注意樣品的濃度。多糖樣品的濃度會(huì)對(duì)其形態(tài)產(chǎn)生顯著的影響，采用較高濃度的多糖溶液時(shí)，容易形成聚集體，而較低濃度的多糖溶液則可以避免聚集體的產(chǎn)生。如果濃度過(guò)大，可能影響大分子的形態(tài)，導(dǎo)致無(wú)法觀察到多糖本身的結(jié)構(gòu)。

1 National Pharmacopoeia Committee(國(guó)家藥典委員會(huì)).Chinese Pharmacopoeia(中國(guó)藥典)，Vol.Beijing:Chemical Industry Press，2005.68.

2 Cao G(曹崗)，Zhang XY(張曉炎)，Cong XD(叢曉東)，et al.The research progress of polysaccharides fromAtractylodes macrocephalaKoidz.J Beijing Union Univ，Nat Sci(北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)，自然科學(xué)版)，2009，23:14-18.

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Chromatographic Analysis and Atomic Force Microscope Observation of Polysaccharide Extracted from Atractylodes macrocephala Koidz.

WU Le-qin，JIANG Shao-fen，ZHANG Jing*
College of Food Engineering and Nutrition Science，Shanxi Normal University，Xi’an 710062

Polysaccharides extracted from the stem ofAtractylodes macrocephalaKoidz by hot water，were fractionated by DEAE-52 cellulose chromatography，and purified by Sephadex G-200 gel filtration chromatography to obtain a fraction，named WAM-1.HPLC and GC analysis showed that WAM-1 was a homogeneous and consisted of glucose and galactose in the molar ratio of 3.01∶1.The molecular morphology of WAM-1 was observed under an atomic force microscope (AFM).The results showed that WAM-1 existed in different forms with different concentrations.The concentration of polysaccharide had effects on the conformation and form of chain interactions，which might be related to the interaction of intramolecular and intermolecular hydrogen bonds.At 10 μg/mL，the morphology of WAM-1 was observed clearly in rigid chains with many branches.

polysaccharide;purification;atomic force microscope

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0631-05

2010-10-15 接受日期:2011-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10874108);陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(SJ08A16)

*通訊作者 E-mail:zhangjin@snnu.edu.cn