特異性siRNA下調(diào)Cr－1基因表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響

朱祥 馬圭 祁衛(wèi)東 蔣鵬程 范鈺

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所 江蘇鎮(zhèn)江 212002）

Cripto－1基因最初是通過(guò)克隆人畸胎瘤細(xì)胞系中的互補(bǔ)DNA文庫(kù)得到，故相應(yīng)地命名為畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子－1（teratocarcinoma－derived growth factor－1，TDGF1），定位在人類(lèi)染色體3p21.3［1］，編碼cripto蛋白，故一般稱(chēng)為Cr－1基因。研究發(fā)現(xiàn)，Cr－1基因在許多惡性實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈過(guò)度表達(dá)，而它在正常組織中都不表達(dá)或低表達(dá)［2，3］。有研究發(fā)現(xiàn)，Cr－1基因與某些腫瘤如結(jié)直腸癌［4～8］侵襲有關(guān)。但國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)關(guān)于此基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲方面的研究。

本課題組借助于RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，以化學(xué)合成Cr－1基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染處理結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，觀察了Cr－1基因siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)癌細(xì)胞侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，本院組織生物標(biāo)本庫(kù)凍存。Cr－1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆轉(zhuǎn)錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 siRNA序列 根據(jù)Cr－1基因mRNA序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了6個(gè)siRNA。另外，設(shè)計(jì)了一個(gè)錯(cuò)配 siRNA（正義 鏈：5＇－UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd－3 ＇； 反 義 鏈： 5 ＇－ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT－3＇）作為對(duì) 照。所有siRNA均由美國(guó)Dharmacon公司采用化學(xué)合成方法合成。Cripto－1siRNA序列見(jiàn)表1。

表1 Cripto－1siRNA 序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染處理 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液、37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，將1.0×105對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，1ml／well，培養(yǎng)過(guò)夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。基本操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞分組：（1）空白對(duì)照組（Con－A）：未經(jīng)任何處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞；（2）空載對(duì)照組（Con－B）：即脂質(zhì)體對(duì)照組；（3）錯(cuò)配對(duì)照組（Scr－siRNA）；（4）siRNA 組：10%胎牛血清的 RBMI 1640中含不同濃度（3.125、6.25、12.5nmol／L）的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。

1.2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞Cr－1基因檢測(cè)

1.2.2.1 mRNA水平 采用熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測(cè)。收集細(xì)胞，以TRIzol抽提細(xì)胞總RNA，取總RNA 1μg，以oligo dT（15mer）為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Cripto－1定量 PCR 引物：上游：5＇－CAATTCGGCCTCGGTCTTC－3＇；下游：5＇－TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT－3＇。 FAM 探 針：5＇－CATGGGTGCCCCGACGTTGC－3＇－TAMRA。以3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為：95℃，預(yù)變性3min，95℃，30s；52℃，45s；72℃，45 s；35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸7min。

1.2.2.2 蛋白水平 采用蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)。提取對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行常規(guī)Western blot檢測(cè)。利用Kodak Digital Science 1DImage Analysis Software（Eastman Kodak Company，USA）測(cè)定 Western blot條帶凈灰度值，并與內(nèi)參照β－actin的測(cè)定結(jié)果相比較，計(jì)算其比值。

1.2.3 軟瓊脂集落形成試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法［9］，進(jìn)行軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)，觀測(cè)Cr－1siRNA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響。

1.2.4 體外侵襲試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法［10］，在Boyden小室模型中進(jìn)行觀察。400倍光鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞侵襲能力。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，每組計(jì)數(shù)3份樣本。

2 結(jié) 果

2.1 Cr－1siRNA的篩選 為探討Cr－1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用，本研究首先根據(jù)該基因mRNA序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并用化學(xué)方法合成了3個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測(cè)Cr－1基因mRNA水平。結(jié)果顯示，這3個(gè)siRNA均能明顯抑制Cr－1mRNA水平，以S1效果最好，而空載對(duì)照組和錯(cuò)配對(duì)照組Cr－1mRNA水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）（見(jiàn)圖1）。

圖1 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響

2.2 siRNA敲除對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Cr－1基因的影響 本研究進(jìn)一步采用S1siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Cr－1基因mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞比較，siRNA組Cr－1mRNA和蛋白水平明顯降低（P＜0.05，見(jiàn)圖2、圖3）。

圖2 siRNA對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞Cr－1mRNA水平的影響

圖3 siRNA對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞Cr－1蛋白水平的影響

2.3 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞軟瓊脂集落形成的影響 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長(zhǎng)呈劑量依賴性減少（P＜0.05，見(jiàn)圖4）。

圖4 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響

2.4 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響 采用Boyden小室模型檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，siRNA組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降，且與濃度相關(guān)（P＜0.05，見(jiàn)圖5）。

圖5 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞體外侵襲的影響

3 討 論

在基因研究領(lǐng)域中，RNAi和siRNA已引起了廣泛的注意。RNAi是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mRNA的生物學(xué)現(xiàn)象，能夠使基因的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子敲除，其效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義RNA［11］。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級(jí)生命活動(dòng)。而siRNA是指RNAi過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的長(zhǎng)約21～25核苷酸（nt）的小雙鏈RNA分子，是RNAi作用機(jī)制的重要中間效應(yīng)分子。而且已有人工合成的siRNA，具有明顯的敲除相應(yīng)基因mRNA的效果［10，12～14］。由于siRNA 具有高效敲除基因表達(dá)的工具，已被廣大科學(xué)工作者用來(lái)研究基因功能和基因治療的工具。

為了解Cr－1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用，本研究根據(jù)Cr－1基因mRNA特點(diǎn)，設(shè)計(jì)siRNA序列，并用化學(xué)方法合成，轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞后，分別采用熒光實(shí)時(shí)定量RT－PCR和wetern blot方法檢測(cè)Cr－1基因mRNA和蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Cr－1基因mRNA和蛋白水平明顯下降，提示Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染成功。說(shuō)明該siRNA可作為研究Cr－1基因功能的有力工具。

接著，我們?cè)隗w外觀察了Cr－1基因siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲的影響。正常真核細(xì)胞，除成熟血細(xì)胞外，大多須粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱(chēng)為錨著依賴性（anchorage dependence）。腫瘤細(xì)胞可以錨著不依賴性狀態(tài)生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂形成集落的多少與惡性程度呈正相關(guān)。癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，則在軟瓊脂上形成的集落數(shù)目多。軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞軟瓊脂集落數(shù)和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。

Boyden小室模型或Transwell是檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲試驗(yàn)的經(jīng)典模型，已被廣泛應(yīng)用于探討癌細(xì)胞侵襲的相關(guān)研究中。本研究將經(jīng)Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染處理的結(jié)直腸癌549細(xì)胞置于Boyden小室模型中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。提示Cr－1下調(diào)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲能力。

本研究提示，Cr－1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中起著重要的作用，以siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力，其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

［1］Ciccodicola A，Dono R，Obici S，et al.Molecular characterization of a gene of the EGF family expressed in undifferentiated human NTERA2teratocarcinoma cells［J］.EMBO J，1989，8：1987－1991.

［2］Persico MG，Liguori GL，Parisi S，et al.Cripto in tumors and embryo development［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1552（2）：87－93.

［3］Salomon DS，Bianco C，De Santis M.Cripto：a novel epidermal growth factor （EGF）－related peptide in mammary gland development and neoplasia［J］.Bioes－says，1999，21（1）：61－70.

［4］Ertoy D，Ayhan A，Sarac E，et al.Clinicopathological implication of cripto expression in early stage invasive cervical carcinomas［J］.Eur J Cancer，2000，36：1002－1007.

［5］Normanno N，De Luca A，Bianco C，et al.Cripto－1 overexpression leads to enhanced invasiveness and resistance to anoikis in human MCF－7breast cancer cells［J］.J Cell Physiol，2004，198：31－39.

［6］范鈺，王崇強(qiáng)，張尤歷，等.大腸癌患者血清畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子1臨床檢測(cè)意義［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2007，17（6）：488－489

［7］范鈺，張尤歷，吳鶯，等.大腸癌組織畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子1蛋白表達(dá)及臨床意義［J］.中華消化內(nèi)鏡雜志，2007，12（6）：442－443.

［8］范鈺，鄭樹(shù)，丁佳逸，等.結(jié)直腸癌組織cripto基因mRNA水平及臨床意義［J］.中國(guó)臨床實(shí)用醫(yī)學(xué)，2008，2（3）：12－14.

［9］范鈺，鄭樹(shù)，趙剛.青蒿琥酯對(duì)乳腺癌 MCF－7細(xì)胞抗失巢凋亡的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22（3）：571－575.

［10］Fan Y，Zhang YL，Wu Y，et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells［J］.World J Gastroenterol，2008，14（3）：428－434.

［11］Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391 （6669）：806－811.

［12］Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21－nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］.Nature，2001，411（6836）：494－498.

［13］Zhang YL，Pang LQ，Wu Y，et al.Significance of BclxL in human colon carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2008，14（19）：3069－3073.

［14］范鈺，張尤歷，張宇川，等.siRNA敲除STAT3基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞侵襲的抑制［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2007，17（1）：46－48.