煙草青枯病病圃土壤微生物多樣性初步分析

蔡劉體 ，商勝華 ，胡重怡 ，王麗麗 ，劉艷霞 ，汪漢成 ，楊興明 ，石俊雄*

1.貴州省煙草科學(xué)研究所，貴陽(yáng)市金陽(yáng)新區(qū)云潭北路 550081

2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京市衛(wèi)崗?fù)l(wèi)路1號(hào) 210095

煙草青枯病是煙草的重要病害之一，幾乎分布于世界上所有的烤煙種植區(qū)，其中熱帶和亞熱帶煙區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重［1］。在我國(guó)，煙草青枯病是危害南方煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的主要病害，一旦發(fā)病往往會(huì)造成整株死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。目前，在煙葉生產(chǎn)過(guò)程中盡管采用化學(xué)藥劑防治［4-6］、生物防治［7-9］、合理輪作［8，10-11］、種植抗病品種［12-14］、調(diào)整土壤微生物和調(diào)整煙苗移栽期等綜合措施來(lái)防治煙草青枯?。?5］，但仍無(wú)法有效控制該病的發(fā)生。在煙草青枯病生物防治研究方面，目前主要是利用青枯菌的拮抗微生物來(lái)防治煙草青枯病，雖然篩選拮抗微生物及其在實(shí)驗(yàn)室或溫室中拮抗試驗(yàn)效果不錯(cuò)的研究報(bào)道較多［16-18］，但是在大田生產(chǎn)上卻鮮有應(yīng)用成功的報(bào)道。主要原因之一是植煙土壤是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，耕作層土壤中微生物眾多，包含細(xì)菌、真菌和病毒等,其微生物的多樣性和復(fù)雜性對(duì)青枯菌的拮抗微生物定殖和擴(kuò)繁有一定影響。因此，分析煙草青枯病土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，將有利于拮抗微生物的定殖、擴(kuò)繁和拮抗作用的發(fā)揮。目前，對(duì)土壤微生物群落的分析，尤其是快速分析非常困難［19］，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展以及PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)的日趨成熟，一些建立在 PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的分子生物學(xué)分析方法如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）［20］、末端 限制性片段多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP）和16S保守區(qū)域片段文庫(kù)的構(gòu)建［21］等技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來(lái)。這些方法不需要培養(yǎng)、分離和純化微生物，也不受微生物是否可在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的限制,解決了傳統(tǒng)微生物多樣性分析中的一些分離培養(yǎng)方面的問(wèn)題。本研究利用微生物保守區(qū)域片段文庫(kù)構(gòu)建，初步分析了煙草青枯病土中細(xì)菌、真菌的多樣性，旨在為利用青枯病拮抗菌有效防治該病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草青枯病土壤取自貴州省煙草科學(xué)研究所福泉煙草青枯病病圃。五點(diǎn)混合法采集土壤樣品，取土壤表層8～20 cm的土層，過(guò)0.2 mm篩，去除雜質(zhì)。

微生物保守區(qū)域片段的擴(kuò)增引物（表1）由上海生工生物有限公司合成；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、dNTPs、DNA聚合酶、連接酶、克隆載體等試劑購(gòu)自大連寶生物（TAKARA）有限公司；序列測(cè)定由上海生工生物有限公司完成。

表1 用于微生物保守區(qū)域擴(kuò)增的引物信息Tab.1 The informtion of primers used to amplify themicrobial conservative fragments

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA的提取和檢測(cè)

采用玻璃珠均質(zhì)和液氮研磨法相結(jié)合以及SDS-CTAB法，提取病圃土壤中微生物DNA，用純化試劑盒純化獲得DNA。

采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)土壤微生物總DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與DNA純化

以土壤微生物總 DNA為模板，8f，926r；338F，518R為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積為25.0 μL，其中模板（土壤DNA）1.0 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/μL）各1.0 μL，10×PCR Buffer（含有Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）1.0 μL，Taq（5 U/μL）0.2 μL，蒸餾水補(bǔ)體積至25.0 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃變性50 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；最后，72℃ 延伸10 min。

按照TAKARA公司凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物。

1.2.3 微生物多樣性初步分析

保守區(qū)域文庫(kù)中檢測(cè)為陽(yáng)性的單克隆由上海生工生物公司測(cè)序。獲得的序列信息通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov)及EzTaxon網(wǎng)站(www.eztaxon-e.org)進(jìn)行在線分析和比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯病土壤微生物總DNA提取

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取純化后的土壤微生物總DNA，結(jié)果顯示提取的DNA大小約在2.0～10.0 kb范圍之間，通過(guò)DNA試劑盒的純化，可以降低土壤中腐植酸以及多酚類等化合物對(duì)PCR反應(yīng)的影響。

2.2 煙草青枯病土壤微生物16S-rRNA和ITS保守序列文庫(kù)構(gòu)建

以純化的DNA為模板，用細(xì)菌特異性8f和926r引物、真菌特異性338F和518R引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期片段大小一致的條帶，分別在1000 bp和300 bp左右。分別用8f，926r引物；338F，518R引物擴(kuò)增的產(chǎn)物構(gòu)建文庫(kù)，從文庫(kù)中隨機(jī)挑取部分單菌落，用PCR方法檢測(cè)其攜帶的片段，部分瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，圖1表明隨機(jī)挑取的大多數(shù)單菌落攜帶有目的條帶。陽(yáng)性克隆的序列的測(cè)定由上海生工生物有限公司完成。

圖1 PCR檢測(cè)隨機(jī)挑取的單克隆菌落的插入片段Fig.1 Detection of the insert fragments by PCR from some clones selected randomly

2.3 煙草青枯病土壤細(xì)菌類和真菌類微生物的多樣性

煙草青枯病土壤中獲得的細(xì)菌類信息如表2所示，結(jié)果顯示，土壤中含有假單胞桿菌屬類和鞘氨醇桿菌類等豐富細(xì)菌類微生物種類，其中包含部分不可培養(yǎng)假單胞桿菌、芽孢菌等細(xì)菌，還有部分序列通過(guò)比對(duì)沒(méi)有獲得相似性比較高的信息。表3結(jié)果顯示煙草青枯病土壤中真菌類包括黑霉菌，腐質(zhì)霉屬真菌，尖孢鐮刀菌及一些不可培養(yǎng)的真菌，其中霉菌類和不可培養(yǎng)的真菌類包括的菌類比較豐富。

表2 煙草青枯病病圃土壤微生物中部分細(xì)菌信息Tab.2 Partial bacteria information of soil microbes from tobacco bacterial wilt disease nursery

表3 煙草青枯病病圃土壤微生物中部分真菌類信息Tab.3 Partial fungi information of the soil microbes from tobacco bacterial wilt disease nursery

3 小結(jié)與討論

土壤中微生物群落的快速分析比較困難，采用遺傳物質(zhì)水平上分析微生物的多樣性，既克服了以往用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)來(lái)分析土壤微生物費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，又可挖掘不可培養(yǎng)的微生物信息，因此末端限制性片段多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳等分子手段已廣泛地應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性分析，以及微生物生態(tài)研究和檢測(cè)［22-23］。但這些不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)分析方法都依賴于所提取的土壤微生物總DNA的質(zhì)量［24-26］。土壤中含有腐植酸、多酚類化合物、重金屬等多種生物活性抑制物，可能影響土壤DNA的提取質(zhì)量，抑制DNA聚合酶的活性從而影響土壤微生物多樣性的分析，如果提取的DNA質(zhì)量不高，如含有腐植酸或多酚類化合物，將影響后續(xù)微生物多樣性分析的效果。SDS和CTAB都可用于細(xì)胞裂解，用SDS-CTAB法提取土壤總DNA，既可達(dá)到裂解效果，還有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA的質(zhì)量。本試驗(yàn)采用SDS-CTAB法獲得了2.0～10.0 kb范圍片段的DNA，經(jīng)過(guò)純化后用于PCR擴(kuò)增的模板，PCR擴(kuò)增效果比較好。煙草青枯病病圃土壤微生物群落中含有伯克霍爾德氏菌（Burkholderia fungorum）、假單胞桿菌屬類（Pseudomonas graminis）、黑 霉 菌（Aspergillus niger）、尖 孢 鐮 刀 菌 屬（Fusarium oxysporum）等豐富的細(xì)菌類和真菌類微生物，也包括部分不可培養(yǎng)的微生物。

通過(guò)保守區(qū)域文庫(kù)構(gòu)建，雖然通過(guò)測(cè)序獲得了部分的微生物遺傳信息，但仍然只是土壤中的部分信息。一方面可能是測(cè)序樣本還不夠多的原因，另一方面跟微生物保守區(qū)域文庫(kù)質(zhì)量本身有很大的關(guān)系［27-28］。本研究只對(duì)細(xì)菌和真菌保守區(qū)域構(gòu)建文庫(kù)，對(duì)土壤中的其它微生物（古生菌和病毒類）還不能全面認(rèn)識(shí)，煙草青枯病土壤中微生物多樣性和可能發(fā)生的變化，尚需采用文庫(kù)構(gòu)建與 DGGE 技術(shù)［20，29］、T-AFLP 技術(shù)［30］、高通量測(cè)序技術(shù)［31-32］或微生物芯片技術(shù)［33］相結(jié)合，綜合分析土壤中微生物多樣性的構(gòu)成，這方面有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

［1］Hayward A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum［J］.Annu Rev Phytopathol，1991，29：65-87.

［2］陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等.全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)省(區(qū))煙草侵染性病害調(diào)查報(bào)告［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，1997（4）：1-7.

［3］孔凡玉.煙草青枯病的綜合防治［J］.煙草科技，2003（4）：42-43，48.

［4］羅戰(zhàn)勇，陳元生，周會(huì)光.防治煙草青枯病的藥劑篩選試驗(yàn)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（1）：42-43.

［5］陳永惠，黃福新.煙草青枯病藥劑防治試驗(yàn)［J］.廣西植保，1996（4）：23-25.

［6］盧洪興，曾軍，邱志丹.煙草青枯病發(fā)生與藥劑防治研究［J］.福建省農(nóng)科院學(xué)報(bào)，1996，11（3）：41-45.

［7］Fujie M，Takamoto H，Kawasaki T，et al.Monitoring growth and movementofRalstonia solanacearum cellsharboring plasmid pRSS12 derived from bacteriophage Ф RSS1［J］.J Biosci Bioeng，2010，109（2）：153-158.

［8］Jones J B，Jackson L E，Balogh B,et al.Bacteriophages for plant disease control［J］.Annu Rev Phytopathol，2007，45：245-262.

［9］郭堅(jiān)華，孫平華，吳云波.植物細(xì)菌性青枯病的生物防治機(jī)制和途徑［J］.中國(guó)生物防治，1997，13（1）：42-46.

［10］張竹青，羅寬，高必達(dá).七株抗青枯病菌生防菌的初步鑒定［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，28（6）：512-513.

［11］董春，董成剛，趙青峰.利用拮抗細(xì)菌防治煙草青枯病初步研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（5）：28-30.

［12］黃福新，陳永惠，周興華.煙草青枯病綜合防治研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997（1）：32-35.

［13］朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國(guó)煙草病蟲(chóng)害防治手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［14］匡傳富，羅寬.煙草品種對(duì)青枯病抗病性及抗性機(jī)制的研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，28（5）：395-398.

［15］紀(jì)成燦，方樹(shù)民，顧鋼.煙草品種抗青枯病鑒定中的相關(guān)因素分析［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，2000（2）：1-4.

［16］Lwin M，Ranamukhaarachchi S L.Development of biological control of Ralstonia solanacearum through antagonistic microbial populations［J］.International Journal of Agriculture&Biology，2006，8（5）：657-660.

［17］張深，吳洪田，霍沁建，等.煙草青枯病拮抗菌的篩選及抑菌活性的測(cè)定［J］.煙草科技，2007（6）：56-58.

［18］Wang A A,Zhao Z F,Liu Z Z,et al.Effect of K1,K2 anti-bacterial agents on tobacco Ralstonia Solanacearum［J］.Engineering,2010（2）：930-934.

［19］Marsh T L,Saxman P,Cole J,et al.Terminal restriction fragment length polymorphism analysis program,a webbased research tool for microbial community analysis［J］.Applied and Environmental Microbiology,2000,66（8）：3616-3620.

［20］Fischer S G,Lerman L S.DNA fragments differing by single basepairsubstitutionsareseparated in denaturing gradient gels:Correspondence with melting theory［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(6):1579-1583.

［21］Liu W T,Marsh T L,Cheng H,et al.Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA［J］.Applied and Environmental Microbiology,1997,63(11):4516-4522.

［22］孫慶華，柏耀輝，趙翠，等.DGGE、T-RFLP、LH-PCR對(duì)兩種活性污泥的微生物種群多樣性分析的比較［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2009（8）：1365-1370.

［23］張漢波，段昌群，屈良鵠.非培養(yǎng)方法在土壤微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2003（5）：131-136.

［24］Degrange V，Bardin R.Detection and counting of nitrobacter populations in soil by PCR［J］.Appl Environ Microbiol,1995，61(6):2093-2098.

［25］邢薇，左劍惡，林甲，等.20℃ EGSB反應(yīng)器中顆粒污泥的微 生 物 種 群 結(jié) 構(gòu) 分 析［J］.環(huán) 境 科 學(xué) ，2008，29（9）：2558-2563.

［26］胡磊，楊廣，尤民生.茶園土壤微生物總DNA不同提取方法的比較［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010（2）：361-368.

［27］Hu Y,Fu C,Yin Y,et al.Construction and preliminary analysis of a deep-sea sediment metagenomic fosmid library from Qiongdongnan Basin,South ChinaSea［J］.Mar Biotechnol,2010,12(6)：719-727.

［28］Castro A P,Quirino B F,Allen H,et al.Construction and validation of two metagenomic DNA libraries from Cerrado soil with high clay content［J］.Biotechnol Lett,2011,33（11）：2169-2175.

［29］Saubusse M,Millet L,Delbes C,et al.Application of single strand conformation polymorphism-PCR method for distinguishing cheese bacterial communities thatinhibit Listeria monocytogenes［J］.International Journal of Food Microbiology,2007,116（1）：126-135.

［30］Osborn A M,Moore E R,Timmis K N.An evaluation of terminal restriction fragment length polymorphism(T-AFLP)analysis for the study of microbial community structure and dynamics［J］.Environmental Microbiology,2000,2（1）：39-50.

［31］Schloss P D.A high-throughput DNA sequence aligner for microbial ecology studies［J］.PLoS ONE,2009,4（12）：1-9.

［32］Zaneveld J R,Parfrey L W,Van Treuren W,et al.Combined phylogenetic and genomic approaches for the high-throughput study of microbial habitat adaptation［J］.Trends Microbiol,2011,19（10）：472-482.

［33］Nichols D,Cahoon N,Trakhtenberg E M,et al.Use of ichip forhigh-throughputin situ cultivation of"uncultivable"microbial species［J］.Appl Environ Microbiol,2010,76(8)：2445-2450.