龍 躍,王 超,王武鵬,薛倩倩,寇 嫻,王桂紅
(鄭州大學(xué)化學(xué)系,河南鄭州450001)
雀兒舌頭系大戟科黑鉤葉屬植物(Leptopus chinensis(Bunge)Pojark),別名黑鉤葉,草桂花,黃楊皮(湖北),一葉秋(神農(nóng)架),為一年生草本植物,廣泛分布于吉林,湖北,河南,陜西,山西,甘肅,山東,湖北,四川,云南,西藏等地.其根性溫,中醫(yī)認(rèn)為具有理氣止痛,治療胃病,腹瀉下痢等作用,民間還用來(lái)治療黃疸、胃炎、水腫等多種疾?。?-2].
植物多酚具有多種生物學(xué)活性,包括抗氧化[3]、抗菌[4]、抗腫瘤[5]等,對(duì)植物中多酚物質(zhì)提取分離并進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用具有重要意義.超聲波提取法[6]可以破壞細(xì)胞的細(xì)胞壁,改善目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性,增加提取率,相對(duì)于傳統(tǒng)的超聲波技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中顯示出了明顯的優(yōu)勢(shì)[7-8].目前,利用超聲波進(jìn)行多酚物質(zhì)提取的報(bào)道已有很多,如:大豆異黃酮的提取[9]、茶多酚的提?。?0]、蘋(píng)果多酚的提?。?1]等.本研究首次將超聲波提取法應(yīng)用于雀兒舌頭多酚提取,并著重對(duì)超聲波提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用中草藥雀兒舌頭奠定基礎(chǔ).
實(shí)驗(yàn)材料為采集于河南禹州市的雀兒舌頭全草,沒(méi)食子酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀試劑均為分析純.
美國(guó)Perkin Elmer紫外分光光度計(jì)(型號(hào):lambda 35);KQ—3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Rc-52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SartoriusBS210S電子天平(北京塞多利斯天平有限公司).
1.2.1 多酚含量的測(cè)定
雀兒舌頭多酚含量采用靈敏度高、適合微量多酚含量測(cè)定的普魯士藍(lán)法[12]測(cè)定,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品.
(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(120℃烘干至恒重)15.0 mg,用95%乙醇溶解后,轉(zhuǎn)入200 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容,得75 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液.
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(75 μg/mL)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于 25 mL 容量瓶中,加入FeCl3(0.100 mol/L)1 mL,K3Fe(CN)6(0.008 mol/L)1 mL后,用 HCl(0.100 mol/L)定容至25 mL,放置20 min,在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度,試劑空白為參比.根據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為C=1.894 1A+0.192 2,相關(guān)系數(shù)為0.999 5,式中:A為吸光度;C為沒(méi)食子酸濃度(μg/mL).結(jié)果表明:沒(méi)食子酸0.6~3(μg/mL)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好.
(3)雀兒舌頭多酚得率的計(jì)算
雀兒舌頭多酚含量通過(guò)測(cè)得的吸光度值A(chǔ)換算成所測(cè)試液的濃度C后,由下式得出:
1.2.2 超聲波法提取試驗(yàn)
將雀兒舌頭粉碎,過(guò)0.250 mm篩,稱取一定量干燥后的雀兒舌頭粉末,分別考察乙醇濃度、超聲波功率、料液比、溫度、提取時(shí)間對(duì)雀兒舌頭多酚得率的影響.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇主要影響超聲波提取雀兒舌頭多酚得率的因素及水平進(jìn)行正交試驗(yàn),確定最佳提取工藝.
2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)雀兒舌頭多酚得率的影響
稱取雀兒舌頭3 g,在30 min、料液比為1∶15、溫度為30℃以及150 W超聲波功率的條件下考查乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響,提取結(jié)果見(jiàn)圖1.
由圖1可知,雀兒舌頭多酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高逐漸增大,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% ~70%時(shí)明顯增大,之后下降,說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取多酚有較大影響,體積分?jǐn)?shù)越大提取效果越好,但是在70%以后,得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高并沒(méi)有增大,而是有所下降,因此選擇60%、70%、80%3個(gè)水平條件做進(jìn)一步的正交試驗(yàn).
圖1 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響Fig.1 Effection of ethanol concentration on the yield of polyphenols
2.1.2 料液比對(duì)雀兒舌頭多酚得率的影響
稱取雀兒舌頭3 g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時(shí)間60 min、溫度30℃以及150 W超聲波功率的條件下考查提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響,提取結(jié)果見(jiàn)圖2.
通過(guò)分析圖2可以看出,隨著料液比的增加,多酚得率呈增加趨勢(shì),說(shuō)明隨著料液比的增大,溶劑體積增加有利于多酚的溶出,但料液比不是越大越好,在料液比1∶25時(shí)達(dá)到最大值之后又出現(xiàn)下降,因此選擇得率較大的 1∶20、1∶25、1∶30 3 個(gè)水平條件做進(jìn)一步正交試驗(yàn).
圖2 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effection of ratio of material to liquid on the yield of polyphenols
2.1.3 溫度對(duì)雀兒舌頭多酚得率的影響
稱取雀兒舌頭3 g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶20、提取時(shí)間為50 min以及 150 W超聲波功率的條件下考查提取溫度對(duì)多酚得率的影響,提取結(jié)果見(jiàn)圖3.
圖3 提取溫度對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effection of ultrasonic temperature on the yield of polyphenols
從圖3中可以看出,多酚得率在溫度為30~70℃范圍內(nèi)逐漸增大,在高于70℃時(shí)可能會(huì)繼續(xù)增大.但是考慮到高溫會(huì)使多酚結(jié)構(gòu)遭到破壞,同時(shí)較高的溫度對(duì)設(shè)備要求高,耗能更大,綜合以上因素,取50、60、70℃ 3個(gè)水平做進(jìn)一步正交試驗(yàn).
2.1.4 提取時(shí)間對(duì)雀兒舌頭多酚得率的影響
稱取雀兒舌頭3 g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶20、溫度為30℃以及150 W超聲波功率的條件下考查提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響,提取結(jié)果見(jiàn)圖4.
圖4 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Effection of extraction time on the yield of polyphenols
由圖4我們可以看出,多酚得率隨提取時(shí)間的增加而增大,這主要是由于超聲波對(duì)細(xì)胞膜的破碎程度隨時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng),多酚逐漸溶出,但當(dāng)樣品內(nèi)外提取成分達(dá)到平衡時(shí),即使再增加提取時(shí)間,多酚得率也不會(huì)顯著增加.由圖可知,30~70 min多酚得率呈上升狀態(tài),在70 min后,得率并不再增加,說(shuō)明在70 min超聲波時(shí)間內(nèi),雀兒舌頭多酚已經(jīng)達(dá)到最大溶出率,增加時(shí)間對(duì)多酚得率并無(wú)顯著影響,且增加能耗.綜合考慮,確定70 min為最佳提取時(shí)間.
2.1.5 超聲波功率對(duì)雀兒舌頭多酚得率的影響
稱取雀兒舌頭3 g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶20、溫度為40℃以及50 min提取時(shí)間的條件下考查提取超聲波功率對(duì)多酚得率的影響,提取結(jié)果見(jiàn)圖5.
圖5 超聲波功率對(duì)多酚得率的影響Fig.5 Effection of ultrasonic power on the yield of polyphenols
由圖5可知,多酚得率隨超聲波功率增加而增大,這是由于超聲波對(duì)細(xì)胞膜的破壞程度隨功率的增加而增加,功率高時(shí),破壞程度大,多酚得率高.但在圖上也可以看出,在達(dá)到135 W之后得率反而下降,這是由于功率增加到一定程度后,各種雜質(zhì)也同時(shí)溶出,有效成分的溶解量反而減少,雀兒舌頭多酚得率有所減少.選擇3個(gè)較大的水平條件105、120、135 W做進(jìn)一步正交試驗(yàn).
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,影響多酚得率的主要因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)(A),超聲波功率(B),料液比(C),加熱溫度(D),提取時(shí)間確定為70 min,采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)行綜合考察,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)水平因素表(表1),正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.
由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出,影響雀兒舌頭多酚得率的反應(yīng)條件中各因素的主次為:料液比、溫度、乙醇濃度、超聲波頻率.其中,料液比因素為顯著因素,最優(yōu)的提取工藝為A1B3C2D3,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,功率為135 W,料液比為1∶25,溫度為70℃.
對(duì)正交試驗(yàn)得到的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).取3份雀兒舌頭分別按最佳條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,功率為135 W,料液比為1∶25,溫度為70℃于超聲波清洗儀中水浴提取,提取時(shí)間為70 min,3次提取雀兒舌頭的多酚得率分別為3.25,3.42,3.36 mg/g(RSD=2.3%).試驗(yàn)結(jié)果表明最佳提取工藝穩(wěn)定,值得推廣.
表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factors and levels of orthogonal design
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.2 Results of the orthogonal design and range analysis
表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis
通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、強(qiáng)烈空化效應(yīng)、高加速度、熱效應(yīng)、攪拌作用等,使其應(yīng)用在植物提取方面可加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑,從而提高提取效率,縮短提取時(shí)間,節(jié)約溶劑,并且免去了高溫對(duì)提取成分的破壞.這種具有方便、高效特點(diǎn)的超聲波提取法作為天然產(chǎn)物活性成分分離提取的新技術(shù)具有很高的實(shí)用價(jià)值,值得認(rèn)真探索研究.
本試驗(yàn)建立了利用超聲波技術(shù)提取雀兒舌頭多酚的方法,考察了乙醇濃度,超聲波功率,料液比,加熱溫度以及提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響,通過(guò)正交設(shè)計(jì)對(duì)各因素進(jìn)行了優(yōu)化,獲得了最優(yōu)的工藝參數(shù),試驗(yàn)結(jié)果表明最佳超聲波提取工藝穩(wěn)定,多酚得率高,為以后雀兒舌頭開(kāi)發(fā)利用奠定了一定基礎(chǔ).
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