短暫腦缺血對大鼠海馬腦區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道功能的影響

李建國，劉乃紅，陳建鳴

海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元對于缺血損傷特別敏感，并且在短暫前腦缺血后呈現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡，而CA3和齒狀回神經(jīng)細(xì)胞不受此影響。目前對這種選擇性細(xì)胞死亡的機制仍不清楚［1］。研究表明，細(xì)胞凋亡參與了腦缺血后神經(jīng)元的死亡過程［2］，而且鉀通道和氯通道等離子通道參與細(xì)胞的凋亡過程［3，4］。

目前，除了三類已知基因表達的氯離子通道，如配體門控氯通道（甘氨酸受體和GABA受體）、ClC氯通道（ClC1～ClC7，ClC－K1和ClC－K2）和囊性纖維變性調(diào)節(jié)因子氯通道（CFTR），細(xì)胞膜上還分布著一種功能表達的氯通道，即外向整流氯離子通道（outwardly rectifying chloride channels）。這是一種中等電導(dǎo)大小，具有外向整流特性的氯通道。雖然其分子結(jié)構(gòu)仍然不清楚，但是大量的研究發(fā)現(xiàn)，外向整流氯離子通道參與了細(xì)胞的凋亡性死亡過程［4］，細(xì)胞死亡的程度能夠被氯通道阻斷劑所減緩［5］。因此，認(rèn)為外向整流氯離子通道可能參與了海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元在缺血后出現(xiàn)的遲發(fā)性死亡過程。為探討這種可能性，本實驗運用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察了短暫前腦缺血后，大鼠海馬CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯離子通道活性的變化情況。

1 材料與方法

1.1 腦片的制備與神經(jīng)元的急性分離 按以往報道的方法急性分離神經(jīng)元［6］。實驗采用成年雄性 Wistar大鼠（180g～250 g）。麻醉后（水合氯醛40mg／100g）快速斷頭并取出大腦，在振動切片機上切成厚度400μm的腦片。把切好的腦片放置于通以95%O2和5%CO2混合氣的EBSS液中孵育1h～4h，然后分離出海馬腦區(qū)并放入用100%O2飽和的HBSS液中用鏈白蛋白酶（protease XIV，1.2mg／mL～1.5mg／mL）消化35 min～40min，放到低鈣羥乙基磺酸鈉緩沖液中吹打，制備成細(xì)胞懸液備用，實驗選用形態(tài)為錐形或梭形、有基樹突和頂樹突的錐體神經(jīng)元進行全細(xì)胞記錄。

1.2 全細(xì)胞電流記錄與數(shù)據(jù)分析 實驗采用全細(xì)胞電壓鉗制技術(shù)，電極電阻為3.5MΩ～5MΩ。全細(xì)胞電流通過膜片鉗放大器 （Axopatch 200B）由 A／D轉(zhuǎn)換系統(tǒng)（Digidata 1320）以5 kHz頻率采集，1kHz低通濾波。實驗是在鉗制電壓－40mV的基礎(chǔ)上采用斜坡電壓脈沖程序（從－80mV去極化到＋80 mV，100mV／s），采集頻率為0.1Hz，室溫下記錄。數(shù)據(jù)采集、分析使用pClamp 10.0軟件。羥乙基磺酸鈉緩沖液成分為：羥乙基磺酸鈉140mmol／L，KCl 2mmol／L，MgCl24mmol／L，CaCl20.1mmol／L，葡萄糖23mmol／L，HEPES 15mmol／L，用1nmol／L NaOH將pH值調(diào)定為7.35；浴槽液成分為：NMDG－Cl 140mmol／L，MgCl22mmol／L，Hepes 10mmol／L，葡萄糖10mmol／L，4－AP 2mmol／L，EGTA－Na21mmol／L，用1nmol／LNMDG－OH將pH值調(diào)定為7.3；電極內(nèi)液成分為：NMDG－Cl 25mmol／L，NMDG 115mmol／L，天冬氨酸100，MgCl22mmol／L，EGTA 10mmol／L，Hepes 10mmol／L，EGTA－ Na2ATP 5 mmol／L，用1nmol／L NMDG－OH將pH值調(diào)定為7.3。

1.3 腦缺血模型的制備 成年大鼠，分為CA1錐體神經(jīng)元對照組及缺血再灌注后6h和24h實驗組。采用血管夾閉方法進行短暫前腦缺血（15min）［7］。大鼠以水合氯醛麻醉 （ip，4 0 mg／100g），頸部切口，分離雙側(cè)頸總動脈。將大鼠固定于定位儀后，高溫電凝雙側(cè)椎動脈，禁食過夜。以這種方法制備的大鼠沒有明顯的腦損害，行為正常。第2天，用動脈夾夾閉清醒的大鼠雙側(cè)頸總動脈15min，以造成短暫前腦缺血模型。大鼠在60 s內(nèi)昏迷，翻正反射消失，痛反射消失，雙側(cè)瞳孔放大。腦缺血15min后解除動脈夾，恢復(fù)腦血流。具有這些癥狀的大鼠分別存活6h或24h后進行以下的細(xì)胞分離。部分腦片經(jīng)甲醛溶液固定，克紫染色后光鏡觀察。缺血再灌注后出現(xiàn)驚厥等異常表現(xiàn)的大鼠予以排除，實驗中保持37℃的大鼠體溫。

2 結(jié) 果

2.1 急性分離大鼠海馬神經(jīng)元上外向整流氯離子通道的特性實驗采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，鉗制電壓為－40mV。給予斜坡電壓程序（－80mV～80mV）后，可以在細(xì)胞上記錄到一個雙向電流。此電流具有外向整流特性，在－80mV時的全細(xì)胞電流為（9.11±1.2）pA／pF，在80mV時的全細(xì)胞電流為（64.2±6.9）pA／pF。翻轉(zhuǎn)電位為－36.25mV，接近于本試驗中Cl－的平衡膜電位（－40mV）。氯離子通道阻斷劑DIDS能夠阻斷此通道電流活動。在浴槽液中加入1mmol／L DIDS能夠可逆性阻斷外向整流氯離子通道。在＋80mV膜電位下，通道電流從（64.2±6.9）pA／pF下降到（11.43±13.76）pA／pF（P＜0.01）。詳見圖1。

圖1 大鼠海馬錐體神經(jīng)元上記錄到的外向整流氯通道全細(xì)胞電流圖

2.2 短暫腦缺血后大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道的功能改變 短暫前腦缺血能夠使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元廣泛死亡，腦缺血7d后，CA1區(qū)錐體神經(jīng)元基本全部死亡，而CA3區(qū)和齒狀回細(xì)胞基本正常。

短暫腦缺血后大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道電流持續(xù)性增強。缺血后6h和24h的全細(xì)胞電流從正常的（9.11±1.2）pA／pF（－80mV）和（64.2±6.9）pA／pF（80mV）分別增強為：（15.80±1.70）pA／pF、（17.70±1.93）pA／pF（－80mV）和（120.16±12.30）pA／pF、（129.82±11.83）pA／pF（＋80mV）（P＜0.05），與對照組相比明顯增強。

圖2 短暫腦缺血后大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道電流圖

2.3 腦缺血前后海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道特性的比較 證明外向整流氯通道活動增強是否為腦缺血后易損海馬神經(jīng)元的獨特現(xiàn)象，或者僅僅為缺血后神經(jīng)元的共同反應(yīng)，這對于闡明外向整流氯通道在缺血性腦損傷中的作用十分重要。因此，我們進一步比較了腦缺血前后的CA3區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道的功能變化。采用同樣全細(xì)胞電壓鉗記錄技術(shù)，在CA3區(qū)錐體神經(jīng)元記錄到外向整流氯通道電流。

腦缺血前后的全細(xì)胞電流圖，其電流值無明顯差異。缺血前和缺血后24h的全細(xì)胞電流值分別為（11.4±1.47）pA／pF、（7.97±0.90）pA／pF（－80mV）和（60.14±7.13）pA／pF、（65.66±7.68）pA／pF（＋80mV）（P＞0.05），與對照組相比無明顯變化。

圖3 短暫腦缺血后大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道電流圖

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯通道的功能活動持續(xù)性增強，然而CA3區(qū)細(xì)胞氯通道電流無明顯改變，這同以前報道的腦缺血再灌注后海馬錐體神經(jīng)元的細(xì)胞膜特性變化相符［8］。以往研究觀察到腦缺血后大鼠海馬錐體神經(jīng)元同樣出現(xiàn)選擇性興奮性改變，CA1神經(jīng)元動作電位閾值增加而CA3細(xì)胞無變化。因為氯通道開放能夠?qū)е律窠?jīng)元超級化，所以腦缺血后氯通道活動增強導(dǎo)致的細(xì)胞超極化可能是CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞膜興奮性和自發(fā)放電頻率降低的機制之一。

蛋白激酶能夠調(diào)節(jié)外向整流氯通道的活動。酪氨酸激酶p125能夠激活小腸上皮細(xì)胞膜上的外向整流氯離子通道，酪氨酸激酶p56也可以激活淋巴細(xì)胞膜上的外向整流氯通道，在胞漿側(cè)加入酪氨酸激酶抑制劑可以抑制多種細(xì)胞上的外向整流氯通道電流［9，10］。酪氨酸激酶可被細(xì)胞腫脹和Fas受體信號激活。短暫腦缺血后，CA1錐體神經(jīng)元中Fas受體蛋白及其配體大量表達。因此，推測腦缺血后外向整流氯通道活動增強可能是由于Fas信號通路激活了酪氨酸激酶所致［11］。這與酪氨酸激酶抑制劑能夠保護腦缺血后CA1區(qū)錐體神經(jīng)元死亡相符合［12］。

不同部位的神經(jīng)元對缺血損傷的敏感度不同，15min前腦缺血能夠引起CA1區(qū)錐體神經(jīng)元廣泛死亡，然而基本不影響CA3和齒狀回細(xì)胞。本實驗發(fā)現(xiàn)CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元外向整流氯通道對腦缺血傷害性刺激的反應(yīng)不同，CA1細(xì)胞上氯通道電流增強，而在CA3的細(xì)胞無顯著變化。因此，認(rèn)為腦缺血后CA1細(xì)胞外向整流氯通道活動持續(xù)性增強不但使神經(jīng)元興奮性進行性降低，而且參與了缺血性神經(jīng)元損傷，大量研究［13，14］發(fā)現(xiàn)氯通道參與多種細(xì)胞的凋亡過程也支持我們提出的這一假說。

外向整流氯通道能夠通過轉(zhuǎn)運HCO3－直接降低細(xì)胞內(nèi)pH值，也能夠通過易化Cl－／HCO3－交換體分泌碳酸氫鹽來間接降低細(xì)胞內(nèi)pH值。細(xì)胞內(nèi)酸化后激活酸性核酸內(nèi)切酶，進而參與細(xì)胞凋亡的過程［15，16］。因此，腦缺血后海馬CA1錐體神經(jīng)元外向整流氯通道活動持續(xù)性增強可能通過降低細(xì)胞內(nèi)pH值促進神經(jīng)元凋亡。

外向整流氯通道引起的細(xì)胞容積改變是細(xì)胞凋亡的另一重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，鉀離子和氯離子經(jīng)氯通道和鉀通道外流是細(xì)胞出現(xiàn)凋亡性容積減少的一個重要因素。而凋亡性容積減少是驅(qū)動細(xì)胞死亡重要因素，給予通道阻斷劑能夠抑制凋亡性容積減少和細(xì)胞凋亡［5］。腦缺血后外向整流氯通道被過渡激活后，通過減少細(xì)胞容積誘導(dǎo)海馬CA1錐體神經(jīng)元凋亡過程的發(fā)生。另外，Cl－外流本身亦可通過DNA內(nèi)切酶活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實驗發(fā)現(xiàn)，腦缺血后CA1神經(jīng)元外向整流氯通道活動持續(xù)性增強，而CA3神經(jīng)細(xì)胞的氯通道無顯著變化，這可能是CA1區(qū)椎體神經(jīng)元對腦缺血易損的一個重要機制。

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