重組人生長激素對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠神經(jīng)元凋亡及XIAP、Caspase－3表達(dá)的影響

郝慶偉，鄭輯英，李光來，薛國芳，耿 瑜

癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）是常見的臨床急癥，是細(xì)胞層面的自身失控性發(fā)作。國際癲癇組織定義為癲癇連續(xù)發(fā)作之間意識(shí)未完全恢復(fù)又頻繁再發(fā)，或發(fā)作持續(xù)30min以上不自行停止。癲癇連續(xù)發(fā)作30min后，海馬神經(jīng)元開始死亡［1］。細(xì)胞凋亡是SE后腦神經(jīng)元死亡的形式之一，在SE后腦神經(jīng)元死亡過程中扮演重要角色。近年來，一些研究表明，生長激素（GH）能改善大腦缺血缺氧引起的損傷，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活等作用［2，3］。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用重組人生長激素（rhGH）觀察大鼠SE后大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因XIAP、Caspase－3的表達(dá)情況，探討rhGH干預(yù)對(duì)SE導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的影響及其可能機(jī)制，以期為rhGH應(yīng)用于臨床SE的治療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性 Wistar大鼠54只，鼠齡3個(gè)月～4個(gè)月，體重180g～240g，山西醫(yī)科大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。重組人生長激素注射液由長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；匹羅卡品購自美國Sigma公司；兔抗鼠XIAP多克隆抗體、兔抗鼠Caspase－3多克隆抗體、TUNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒均系武漢博士德公司提供；氯化鋰購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司；DAB試劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司出品；余均為市售分析純品。

1.2 動(dòng)物分組及模型的建立 選用健康成年雄性Wistar大鼠54只，隨機(jī)分為對(duì)照組6只，模型組、rhGH組各24只。模型組、rhGH組再分為4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只，分別對(duì)應(yīng)癲癇持續(xù)狀態(tài)后6h、12h、24h和48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。rhGH組頸部皮下注射重組人生長激素0.1U／（kg·d），對(duì)照組、模型組頸部皮下注射等容積生理鹽水。持續(xù)一周，1次／24h。注射5d后，除對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射氯化鋰127mg／kg，18h后再腹腔注射新鮮配制的毛果蕓香堿（匹羅卡品）30mg／kg，對(duì)照組給予等容積生理鹽水腹腔注射。觀察大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作的時(shí)間和行為表現(xiàn)，癇性發(fā)作持續(xù)超過30min為SE。在SE達(dá)1h時(shí)，腹腔注射地西泮10mg／kg，終止癇性發(fā)作。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后6h、12h、24h和48h分別斷頭取腦，對(duì)大鼠海馬組織進(jìn)行研究，進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。驚厥評(píng)分采用Racine評(píng)分法，出現(xiàn)3級(jí)以上發(fā)作提示造模成功，造模過程中大鼠出現(xiàn)死亡或不符合模型要求者，予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充，以保證每組動(dòng)物6只。

1.3 標(biāo)本處理 各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠用25%烏拉坦4mL／kg深麻醉后，斷頭取腦，大鼠腦組織置入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后，在視交叉后海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，每隔15張連續(xù)取4張，相鄰切片分為四套，分別進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法檢測(cè)，按試劑盒提供的方法進(jìn)行操作，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。

1.5 XIAP、Caspase－3檢測(cè) 采用SABC法（鏈霉親和素－生物素過氧化酶連接法）免疫組化步驟按照試劑盒推薦方法進(jìn)行（常規(guī)SABC法，DAB染色）。胞漿或核膜染色呈棕黃色為蛋白陽性表達(dá)。

1.6 結(jié)果處理 每張切片取5個(gè)視野，在BI－2000圖像分析系統(tǒng)下用400倍顯微鏡下分別測(cè)定每個(gè)視野XIAP、Caspase－3、TUNEL陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)。胞漿或核膜內(nèi)染色呈棕黃色為XIAP蛋白陽性表達(dá)；胞漿或胞核內(nèi)有棕黃色沉淀物為Caspase－3蛋白陽性表達(dá)；細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為TUNEL陽性細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)作行為觀察 正常對(duì)照組均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。模型組和rhGH組大鼠在給予匹羅卡品后10min～30min均出現(xiàn)豎毛，流涎，節(jié)律性點(diǎn)頭，洗臉樣動(dòng)作等面部痙攣樣動(dòng)作，接著出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)前肢陣攣、站立，進(jìn)一步發(fā)展為全身強(qiáng)直－陣攣發(fā)作，雙側(cè)后肢強(qiáng)直，身體背屈，跌倒，反復(fù)發(fā)作，達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)。

2.2 XIAP蛋白的表達(dá) XIAP陽性細(xì)胞主要分布在海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)，其陽性細(xì)胞染色主要為胞漿、突起及核膜中呈棕黃色。對(duì)照組XIAP陽性細(xì)胞僅有微量的基礎(chǔ)表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組6h時(shí)XIAP表達(dá)開始增強(qiáng)（P＜0.05），12h時(shí)XIAP的表達(dá)達(dá)到高峰（P＜0.05），24h時(shí)XIAP的表達(dá)開始減弱（P＜0.05），48h時(shí)XIAP的表達(dá)明顯減弱（P＜0.05）。rhGH組與模型組相比，SE后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（除6h外）XIAP蛋白的表達(dá)均顯著高于模型組（P＜0.05），表現(xiàn)為胞漿及核膜染色，呈棕黃色，胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒聚集。詳見表1。

表1 各組大鼠海馬XIAP陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠海馬XIAP陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組別6h 12h 24h 48h對(duì)照組12.71±1.66模型組 27.35±1.991） 42.05±2.191） 36.17±2.111） 25.43±1.381）rhGH組 32.24±1.251） 55.90±2.371）2） 44.32±1.221）2） 36.92±2.011）2）與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

2.3 Caspase－3蛋白的表達(dá) Caspase－3陽性細(xì)胞主要分布在海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)，其陽性細(xì)胞染色主要表現(xiàn)為胞漿或胞核內(nèi)有棕黃色沉淀物。正常對(duì)照組可見大鼠海馬內(nèi)少量的弱染色的、散在的Caspase－3陽性細(xì)胞。與對(duì)照組相比，模型組6 h時(shí)可見海馬區(qū)內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)開始增多；12h時(shí)可見較多細(xì)胞的胞漿和核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色沉淀物；隨時(shí)間點(diǎn)延長而表達(dá)增加，24 h時(shí)陽性細(xì)胞及染色深度達(dá)高峰；48h時(shí)減少。rhGH組與模型組相比，6h時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；12h時(shí)可見較多陽性細(xì)胞，染色較深；Caspase－3陽性細(xì)胞仍在24h達(dá)高峰，但相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Caspase－3陽性細(xì)胞的表達(dá)較模型組輕微，各時(shí)間點(diǎn)Caspase－3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬Caspase－3陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠海馬Caspase－3陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組別6h 48h對(duì)照組2.34±1.13模型組 13.15±1.831） 26.44±1.091）rhGH組 11.36±2.181） 14.05±1.271）2） 23.05±2.541）2） 17.37±2.171）2）與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) TUNEL陽性細(xì)胞要分布在海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)，其陽性細(xì)胞核染色呈棕黃色。對(duì)照組僅有少量的、散在的TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，著色較淺。模型組6h時(shí)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)開始增多，并隨時(shí)間點(diǎn)的延長陽性細(xì)胞表達(dá)增加，24h達(dá)高峰，48h減少。與模型組相比，rhGH組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)仍在24h達(dá)高峰，但相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組別6h 12h 24h 48h對(duì)照組3.15±0.67模型組 16.43±1.321） 31.33±2.061） 42.96±1.221） 28.95±2.031）rhGH組 13.86±1.311） 19.15±1.221）2） 31.07±1.241）2） 19.86±1.131）2）與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

3 討 論

在大腦癲癇持續(xù)狀態(tài)損傷過程中，有大量神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱為程序性細(xì)胞死亡，是正常細(xì)胞在受到生理性和病理性刺激后，出現(xiàn)的一種自發(fā)性死亡過程。細(xì)胞凋亡現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，在已取得許多非常有價(jià)值的成果中，Caspase的蛋白酶在細(xì)胞凋亡過程中起了重要的作用，通過特異性地裂解底物而發(fā)揮其執(zhí)行細(xì)胞凋亡的作用。目前，人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IAPs有8個(gè)，其中XIAP是唯一可與凋亡啟動(dòng)因子Caspase－9及效應(yīng)因子Caspase－3、Caspase－7相結(jié)合的凋亡抑制蛋白。

GH是由垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種非糖基化蛋白。其主要功能包括促進(jìn)機(jī)體生長，減少蛋白質(zhì)消耗，同時(shí)，GH與神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。GH可以通過抑制酪氨酸磷酸化與干擾素所啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而下調(diào)誘生型一氧化氮合酶的產(chǎn)生，進(jìn)而減少細(xì)胞毒作用，甚至還可以抑制脂多糖誘導(dǎo)單核細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤壞死因子，從而減輕炎癥反應(yīng)，而這對(duì)減輕大腦癲癇持續(xù)狀態(tài)損傷后減少神經(jīng)元的凋亡有一定的益處。但其具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究，但這有可能為臨床治療癲癇持續(xù)狀態(tài)提供一個(gè)新的思路和方法。

［1］Edward MM.Status epilepticus：Current treatment strategies［J］.The Neurohospitalist，2011（1）：23－31.

［2］Azcoitia I，Perez－Martin M，Salazar V，etal.Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampus［J］.Neurobiol Aging，2005，26（5）：697－703.

［3］Shin DH，Lee E，Kim JW，etal.Protective effect of growth hormone on neuronal apoptosis after hypoxia－ischemia in the neonatal rat brain［J］.Neuroscience Letters，2004，354（1）：64－68.