丹星通絡(luò)湯治療大鼠腦缺血再灌注Bax蛋白表達的影響

董幼溪，張 巾，劉 耘

缺血性腦血管病屬于中醫(yī)的“中風(fēng)”范疇，中風(fēng)病理性質(zhì)多屬本虛標(biāo)實。肝腎陰虛，氣血衰少為致病之本，風(fēng)、火、痰、氣、瘀為發(fā)病之標(biāo)，兩者可互為因果。導(dǎo)致陰陽失調(diào)、氣血逆亂，出現(xiàn)昏仆、半身不遂、口眼歪斜等癥。其中血瘀貫穿病程始終，所以治療多采用活血化瘀法。丹星通絡(luò)湯具有通腑化瘀、祛痰開竅的作用，使腑氣通、痰熱去、九竅利。在臨床上對預(yù)防和治療缺血性腦血管病具有一定療效，但作用機制尚未闡明。Oltvai等［1］發(fā)現(xiàn)Bax的高表達可加速細胞的凋亡。本文通過觀察丹星通絡(luò)湯對腦缺血再灌注損傷海馬區(qū)Bax蛋白表達的影響，進一步探討丹星通絡(luò)湯保護腦組織作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠40只，雌雄不拘，體重220g～250 g，購于大連醫(yī)科大學(xué)動物中心。

1.1.2 藥品、試劑及儀器 丹星通絡(luò)湯由丹參、膽南星、三七、川芎、紅花、大黃、白術(shù)、澤瀉、黃芪、黃芩、槐花、葛根、防風(fēng)、元參190g生藥組成，煎成濃度為1g／mL的藥液。尼莫地平片由山西亞寶藥業(yè)提供；兔抗鼠Bax單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；10%水合氯醛、4%多聚甲醛、顯微鏡CH30RF200。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥途徑 SD大鼠40只，隨機分成假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、丹星通絡(luò)湯小劑量組、丹星通絡(luò)湯大劑量組，每組8只。自然光照下飼養(yǎng)，假手術(shù)組和模型組每日生理鹽水灌胃1次（0.75mL／100g），連續(xù)7d；尼莫地平組每日尼莫地平灌胃1次（1mL／100g）；丹星通絡(luò)湯小劑量組（0.75mL／100g）、大劑量組（1.5mL／100g）每日丹星通絡(luò)湯灌胃1次，連續(xù)7d。于第7天給藥2h后開始手術(shù)。

1.2.2 模型制作 術(shù)前禁食12h，不禁水。10%水合氯醛腹腔麻醉，參照Longa［2］線栓法，加以改進，自制直徑為0.26mm的尼龍線栓子制備大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。缺血2h后拔除尼龍線10mm，造成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組除不送入栓線外，其余處理皆同大腦中動脈線栓模型手術(shù)。神經(jīng)病學(xué)評分采用Longa 5級4分法：1分～3分為模型成功標(biāo)志，首次評分為0分或4分、有呼吸困難、提前死亡及處死時發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血的動物均棄之不用。此外對于手術(shù)中出血過多的動物也棄去。隨機補充，保證每組8只。

1.2.3 標(biāo)本及病理切片制備 大鼠腦缺血再灌注24h后，麻醉大鼠，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室主動脈插管，在右心耳剪開一小口作出口，先以37℃生理鹽水快速灌注，沖洗血液，再以4%的多聚甲醛固定液灌注固定，持續(xù)30min后斷頭取腦，冠狀面海馬區(qū)取腦組織（厚約2.5mm）切片，保存于4%多聚甲醛溶液中。固定1h，常規(guī)石蠟包埋、超薄切片機切片。

1.2.4 HE染色 切片常規(guī)脫蠟，蘇木素及伊紅染色，脫水、透明、封片，光鏡下觀察。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色及檢測Bax蛋白表達 采用SP法切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫孵育15min，PBS洗5min×3次，熱修復(fù)抗原15min；滴加1∶100稀釋的Bax一抗，4℃冰箱過夜，PBS洗5min×3次；滴加二抗，37℃孵育20min；PBS洗5min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。每張切片于400倍光鏡下采集10個具有代表性以缺血側(cè)海馬區(qū)為主的互不重疊視野，應(yīng)用圖像分析軟件測量每個視野的平均光密度（OD）值。以O(shè)D值大小反映蛋白表達的多少。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計量資料采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色 假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，海馬神經(jīng)元呈圓形或卵圓形，胞體較大，染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯。模型組大腦皮層及海馬椎體層的神經(jīng)細胞間隙增寬，海馬區(qū)神經(jīng)元明顯變性，胞體腫脹，胞漿透亮，呈空泡樣變化，嗜酸性染色減弱，核固縮，核溶解，核體不規(guī)則，周邊可見中性粒細胞浸潤，膠質(zhì)細胞數(shù)量增多。各用藥組海馬區(qū)也可見神經(jīng)元變性，核固縮，核溶解，但數(shù)量明顯少于模型組，且呈劑量依賴性，丹星通絡(luò)湯大劑量組及尼莫地平組改善最為顯著。

2.2 大鼠腦組織海馬區(qū)Bax蛋白的表達 顯微鏡下觀察胞質(zhì)中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。假手術(shù)組Bax蛋白表達很弱；模型組Bax陽性細胞分布不均勻，在海馬區(qū)較密集，胞質(zhì)著色很深，蛋白表達較假手術(shù)組明顯增強，丹星通絡(luò)湯大、小劑量組以及尼莫地平組Bax蛋白的表達較模型組明顯降低。

2.3 大鼠腦組織海馬區(qū)Bax蛋白的OD值 假手術(shù)組Bax蛋白平均光密度（OD）值表達微弱；腦缺血2h，再灌注24h后，Bax蛋白的表達較假手術(shù)組明顯增強（P＜0.01）；假手術(shù)組Bax蛋白的表達與其他組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；尼莫地平組、丹星通絡(luò)湯小劑量組、丹星通絡(luò)湯大劑量組與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；丹星通絡(luò)湯大劑量組與尼莫地平組、丹星通絡(luò)湯小劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠大腦海馬區(qū)Bax蛋白平均光密度比較（±s）

表1 各組大鼠大腦海馬區(qū)Bax蛋白平均光密度比較（±s）

組別 n Bax 蛋白平均光密度假手術(shù)組8 0.037±0.032模型組 8 0.439±0.0781）尼莫地平組 8 0.199±0.1091）2）丹星通絡(luò)湯小劑量組 8 0.213±0.0381）2）丹星通絡(luò)湯大劑量組 8 0.151±0.0121）2）3）4）與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05；與尼莫地平組比較，3）P＜0.05；與丹星通絡(luò)湯小劑量組比較，4）P＜0.05

3 討 論

近年來，隨著生活水平的不斷提高，缺血性腦血管疾病已經(jīng)成為了臨床的常見病之一?；謴?fù)缺血區(qū)供血成為了臨床治療的目標(biāo)。但是多種腦缺血模型顯示，恢復(fù)血供再灌注之后，腦組織損傷將進一步加重，其發(fā)生機制尚未闡明，目前認(rèn)為腦缺血再灌注損傷后可能引起能量衰竭和酸中毒，產(chǎn)生大量自由基、興奮性氨基酸、磷脂代謝異常、積聚，并引起離子自紊機制破壞，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，最終引起某些原癌基因的表達，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生［3］。凋亡是機體維持自身穩(wěn)定和適應(yīng)環(huán)境必需的生理過程，但凋亡異常增加則是某些損傷因素導(dǎo)致細胞死亡的主要形式［4－6］。1993年時在人體B細胞基因文庫發(fā)現(xiàn)了一種新基因，它是由192個氨基酸殘基組成、相對分子質(zhì)量為210 00的蛋白質(zhì)。在胞質(zhì)中的Bax一般以單體形式存在，然而在細胞發(fā)生凋亡時，與線粒體關(guān)聯(lián)的Bax既能以無活性的單體形式存在，也能以與線粒體膜結(jié)合的大分子量的活性復(fù)合物形式存在。當(dāng)細胞受到死亡信號刺激后，Bax發(fā)生構(gòu)象變化，從胞漿中轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，與抗凋亡蛋白相互作用，引起線粒體膜通透性改變，釋放CytC，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf－1）結(jié)合，引起Apaf－1寡聚，順序激活Caspase－9、Caspase－3，最終導(dǎo)致細胞凋亡［7］。因此腦缺血后，若能及時采取腦保護措施，抑制死亡基因的作用，加強存活基因的功能，將為腦缺血的預(yù)防和治療開辟新的道路［8］。

丹星通絡(luò)湯主要針對腦缺血急性期痰濁與瘀血互結(jié)的原理，以丹參、膽南星為主，活血清熱、祛痰開竅；黃芪補氣活血，三七、紅花活血通絡(luò)；大黃、黃芩、白術(shù)、槐花、元參通腑滋陰瀉熱，標(biāo)本兼顧以達活血通絡(luò)、逐瘀泄熱之功效。作為中藥復(fù)方，合理配伍，具有多靶點，副反應(yīng)小，療效較好的特點，對患者的預(yù)后有很大改善。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，腦組織海馬區(qū)Bax蛋白的表達模型組明顯高于假手術(shù)組，而在丹星通絡(luò)湯大、小劑量組較模型組明顯降低；HE染色結(jié)果顯示，丹星通絡(luò)湯組可明顯減少呈凋亡的病理學(xué)改變的神經(jīng)元的數(shù)量。

丹星通絡(luò)湯可能通過下調(diào)Bax蛋白的表達來抑制腦缺血再灌注損傷細胞的凋亡，從而達到預(yù)防及治療的作用。這也為中醫(yī)治療腦中風(fēng)疾病提供了理論依據(jù)。

［1］Oltvai ZN，Milliman CI，Korsmeyer SJ.Bcl－2heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programmed cell death［J］.Cell，1993，74（4）：609－619.

［2］Longa EZ，Weistein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［3］Charriaut MC，Remolleau S，Aggoun ZD，etal.Apoptosis and programmed cell death：A role in cerebral ischemia［J］.Bio Pham，1998，52（6）：264－269.

［4］Shimizu S，Narita M，Tsujimoto Y.Bcl－2family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome C by the mitochondriam channel VDAC［J］.Nature，1999，399 （6375）：483－487.

［5］Baroer PA，Auer RN，Buchan AM，etal.Understanding and managing ischemic stroke［J］.Can J Physiol Pharmacol，2001，79（3）：283－296.

［6］Zhou NN，Zhu XF，Zhou JM，etal.2－Mcthnxyestradiol induces cell cycle arrest and apoptosis of nasopharyngeal carcinom a cells［J］.Acta Phamacologica Sinica，2004，25（1）：1515－1520.

［7］Newton HB.Molecular neuron－oncology and the development of targeted therapeutic strategies for brain tumors.Part 5：Apoptosis and cell cycle［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2005，5（2）：355－378.

［8］Yu AC，Yung HW，Hui MH，etal.Cycloheximide and actinamycin D delay delay death and affect bcl－2，bax，and ice gene expression in astrocytes under in vitro ischemia［J］.J Neurosci Res，2003，74（2）：318－325.