懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝優(yōu)化

李超柱，陳艷輝，顏穆英，黃學(xué)仁，黃貴秋

（欽州學(xué)院，廣西欽州535000）

懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝優(yōu)化

李超柱，陳艷輝*，顏穆英，黃學(xué)仁，黃貴秋

（欽州學(xué)院，廣西欽州535000）

對(duì)懷地黃和懷山藥混合提取多糖的工藝參數(shù)進(jìn)行研究。通過考察提取溫度、固液比、提取液pH、浸提液與乙醇添加量對(duì)懷地黃和懷山藥混合提取多糖的影響，采用L9（33）正交試驗(yàn)，以多糖含量作為指標(biāo)，確定混合提取多糖的最佳溫度、pH、固液比。結(jié)果：懷地黃和懷山藥混合提取多糖的最佳工藝參數(shù)為，浸提溫度65℃、浸提液pH 5.0、固液比為1∶20（g/mL）、浸提液濃縮比為4∶1，沉降劑乙醇添加量6倍于浸提液體積，混合提取多糖率為44.78%。

懷地黃多糖；懷山藥多糖；提取工藝

Abstract:This essay research on Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted process parameters.By examining the effect of extraction temperature,solid-liquid ratio,extracting solution pH,extract and ethanol adding to Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted,using the L9(33)orthogonal experiment,use an indicator of polysaccharide content to conform the mixed extract polysaccharide of the best temperature,pH,solid-liquid ratio.Result:Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted optimal parameters as follows:extraction temperature of 65 ℃,extracts of pH 5.0,solid-liquid ratio of 1∶20(g/mL),the extract concentration ratio of 4∶1,the settlement agent ethanol add six times the volume of the extract;mixed polysaccharide extracted was 44.78%.

Key words：Rehmannia polysaccharide;huai yam polysaccharide;extraction process

懷地黃[Rehmannia glutinosa f.Yhueichingensis(Chan et Schih）Hsiao，簡稱 RG]為玄參科植物，是常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。熟地是生地的炮制品，具有益精填髓、滋陰補(bǔ)血的功能。用于肝腎陰虛、目昏耳嗚、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、血虛痿黃、心悸怔仲、月經(jīng)不調(diào)、崩漏下血、眩暈耳嗚、須發(fā)早白等癥。懷山藥（Dioscorea opposite Thumb f.Yhueichingensis Hsiao，簡稱DT），又名山芋、菜山藥，為薯蕷科多年生纏繞型草本植物，是營養(yǎng)豐富的藥食同源植物，是中華民族傳統(tǒng)的保健佳品，素有懷參之稱。據(jù)本草綱目記載山藥補(bǔ)虛羸,除寒熱邪氣，補(bǔ)中，益氣力，長肌肉，強(qiáng)陰,久服耳目聰明,輕身延年。李時(shí)珍所著本草綱目中記載，山藥有益腎氣、健脾胃、止瀉痢、化痰涎、潤皮毛等功效?，F(xiàn)代藥理表明,懷地黃、懷山藥具有多種生物活性，一般認(rèn)為其主要活性成分是多糖。由于目前天然產(chǎn)物提取往往采用分別提取而忽略天然產(chǎn)物混合提取，而研究表明，懷地黃和懷山藥混合提取一方面可提高得率，二方面有較好的藥用效果，因此對(duì)天然產(chǎn)物混合提取的研究可將提高它們的經(jīng)濟(jì)效益[1-5]。

本試驗(yàn)通過綜合考察溫度、固液比、提取液pH、浸提液與乙醇添加量對(duì)懷地黃和懷山藥混合提取多糖效果的影響，確定最佳提取工藝，為深入開展懷地黃多糖和懷山藥多糖的綜合利用提供理論參考。

1 材料和儀器

1.1 原料和試劑

懷地黃、懷山藥：均購于欽州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；乙醇、正丁醇、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚試劑：均為分析純，購于南寧藍(lán)天實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；濃硫酸為優(yōu)級(jí)純。

1.2 儀器

LB610型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；RE-5299A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海笠化儀器設(shè)備有限公司；FW－100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取干燥的無水葡萄糖 (105℃干燥至恒重)標(biāo)準(zhǔn)品25.3 mg，于500 mL容量瓶中加蒸餾水定容。分別精確吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL標(biāo)準(zhǔn)液于比色管中，各加蒸餾水至2.0 mL，再分別加入6%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5 mL，迅速振蕩均勻，室溫顯色40 min。另取1 mL蒸餾水，加入等量苯酚溶液和濃硫酸，作為空白對(duì)照，將上述試樣置于SP-2000 UV型紫外可見分光光度計(jì)中，于最大吸收波長490 nm處測(cè)定吸收度,以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)葡萄糖含量（X）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖1。

經(jīng)回歸分析，得到回歸方程Y=0.06741+0.01243X，葡萄糖濃度在0.00506 mg/mL～0.04554 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，R2=0.99966。

2.2 懷地黃和懷山藥混合提取多糖的工藝路線

2.2.1 浸提液與乙醇對(duì)多糖的提取

稱取懷地黃和懷山藥（1∶1）40.2953g，粉碎至100目，加入30倍水，浸提4 h，3000 r/min離心30 min,離心收集得到第1次浸提液。向藥渣中加入20倍水，90℃下浸提2 h后離心收集得到第2次浸提液，合并2次收集的浸提液，各取200 mL Sevag法加入40 mL的Sevag試劑（氯仿與正丁醇體積比為5∶1的混合液），劇烈振蕩30 min，離心，回收上層清液，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行第2次蛋白的去除，離心后取上層清液減壓濃縮至原液體積1/4，采用不同的濃縮倍數(shù)和沉降劑（乙醇）添加量進(jìn)行沉降，3500 r/min離心，收集沉淀物，分析多糖得率。

2.2.2 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝條件的設(shè)計(jì)見表1，分別在不同條件下進(jìn)行懷地黃和懷山藥混合提取多糖，并測(cè)定相應(yīng)條件下多糖含量。

表1 懷地黃和懷山藥混合提取多糖正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment factor level table

2.3 多糖得率的測(cè)定方法

利用苯酚-硫酸法對(duì)供試液懷地黃與懷山藥混合多糖含量進(jìn)行測(cè)定，取2 mL多糖供試液，分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5 mL，迅速振蕩均勻,室溫顯色40 min，測(cè)定各供試液吸收值，利用回歸方程求得供試液中葡萄糖的得率。多糖得率按下式計(jì)算：

式中：X為在Y吸光度下根據(jù)回歸方程計(jì)算所得的值，ρ[6]為校正系數(shù)取 0.9。

3 結(jié)果與討論

3.1 浸提液濃縮倍數(shù)與乙醇添加量對(duì)多糖提取的影響

乙醇是常用的多糖沉降劑。浸提液濃縮倍數(shù)（濃縮比）和乙醇添加量是影響多糖沉降的關(guān)鍵因素，對(duì)RGP的得率有較大的影響，結(jié)果見表2。

表2 濃縮比及乙醇加量對(duì)多糖得率的影響Table 2 Concentration ratio of ethanol addition on the effect of polysaccharide

由表2可知，浸提液濃縮比為4∶1時(shí)，多糖得率達(dá)到最高，為46.84%，這說明濃縮后浸提液過稀和過稠都不利于多糖沉降。此外，多糖得率達(dá)到最高時(shí)乙醇添加量為濃縮液的6倍量，說明盡管沉降劑乙醇可降低多糖溶解度促進(jìn)沉降，但過低或過高的乙醇添加量又會(huì)減少或增加溶液總體積而對(duì)沉降產(chǎn)生不利影響。

3.2 懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝條件的選擇與確定

采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選混合懷地黃和懷山藥（1∶1）提取多糖工藝，在多糖提取中，為了獲得最大多糖含量，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，選擇提取溫度、提取液pH和固液比3個(gè)主要工藝參數(shù)作為考察因素，每因素選取3個(gè)水平，按L9（33）正交表安排試驗(yàn)，以多糖含量作為衡量提取效率的指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝參數(shù)。為了提高其統(tǒng)計(jì)分析的可靠性，每一條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)（n=3），測(cè)定結(jié)果取其平均值供統(tǒng)計(jì)分析用，見表3。

表3 混合懷地黃和懷山藥提取多糖正交試驗(yàn)L9（33）方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment L9(33)scheme andresults

續(xù)表3混合懷地黃和懷山藥提取多糖正交實(shí)驗(yàn)L9（33）方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment L9(33)scheme and results

由表3可見，因素A（提取溫度）對(duì)混合物多糖的提取有顯著影響，而因素C（pH）、B（料液比）對(duì)提取無顯著影響。由極差R得出影響因素大小順序?yàn)椋篈>B>C。最佳提取工藝參數(shù)為A2B1C2。依據(jù)上述最佳工藝A2B1C2驗(yàn)證（n=3），懷地黃和懷山藥混合提取多糖平均含量為44.78%。

4 結(jié)論

懷地黃和懷山藥混合提取多糖的最佳工藝參數(shù)為：浸提溫度 65 ℃、浸提液 pH 5.0、固液比為 1∶20（g/mL）、浸提液濃縮比為4∶1，沉降劑乙醇添加量6倍于浸提液體積；混合提取多糖率為44.78%?？蔀樯钊腴_展懷地黃多糖和懷山藥多糖的綜合利用提供理論參考。

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The Optimization Process of Extracting Polysaccharide from the Mixture of Rehmannia and Huai Yam

LI Chao-zhu,CHEN Yan-hui*,YAN Mu-ying,HUANG Xue-ren,HUANG Gui-qiu
（Qinzhou University,Qinzhou 535000,Guangxi,China）

2012-03-13

李超柱（1957—），男（漢），副教授，學(xué)士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)和有機(jī)合成。

*通信作者：陳艷輝（1958—），女（漢），教授，學(xué)士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)和有機(jī)合成。