有機(jī)氮源對谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-纈氨酸的影響*

徐慶陽，孫家凱，吳曉嬌，王晶，謝希賢，陳寧

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

有機(jī)氮源對谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-纈氨酸的影響*

徐慶陽，孫家凱，吳曉嬌，王晶，謝希賢，陳寧

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

以L-纈氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌XV0505為供試菌株，研究有機(jī)氮源對L-纈氨酸發(fā)酵的影響，確定了玉米漿代替豆餅水解液作為有機(jī)氮源的發(fā)酵工藝，降低了發(fā)酵成本;考察不同玉米漿濃度對谷氨酸棒桿菌XV0505發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸過程中生物量、耗糖速率、L-纈氨酸產(chǎn)量、副產(chǎn)物積累及氨消耗等方面影響，確定了玉米漿的適宜添加濃度;考察了玉米漿與生物素不同配比對L-纈氨酸分批發(fā)酵過程的影響，確定了最適生物素添加濃度。與原工藝相比，新工藝的菌體生物量及產(chǎn)酸提高了13.2%和18.5%。

有機(jī)氮源，L-纈氨酸，玉米漿，生物素

L-纈氨酸屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一，除用于一般營養(yǎng)型素膳外，還大量用于配制治療型特種氨基酸輸液、合成食品抗氧化劑和多肽藥物，在醫(yī)學(xué)研究和治療中的生理學(xué)作用日益受到重視[1］。目前微生物發(fā)酵法是大規(guī)模生產(chǎn)L-纈氨酸的首選技術(shù)。現(xiàn)常用L-纈氨酸生產(chǎn)菌大多由谷氨酸棒桿菌、黏質(zhì)賽氏桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌及大腸桿菌選育而來[2］。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和及可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，是一種非常經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法[3］。因此，選育適合工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌種以及獲得最佳發(fā)酵工藝條件均是提高L-纈氨酸發(fā)酵水平的有效途徑。

氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)和合成L-纈氨酸氨基的來源，其中無機(jī)氮源是微生物生長的速效氮源，而有機(jī)氮源能夠為菌體生長提供氮元素及必需的生長因子，選擇合適的有機(jī)氮源對提高L-纈氨酸產(chǎn)量以及降低原料成本具有重大意義[4］。本文研究了不同有機(jī)氮源對谷氨酸棒桿菌XV0505菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的影響，確定了L-纈氨酸發(fā)酵過程中玉米漿代替豆餅水解液作為有機(jī)氮源的發(fā)酵工藝，在降低原料成本的同時，提高了L-纈氨酸的產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)，天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，酵母粉 10，豆餅水解液 10 mL，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 5，KH2PO41，pH 7.0～7.2，0.75×105Pa滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 80，(NH4)2SO44，MgSO4·7H2O 1，KH2PO42，玉米漿 35 mL，F(xiàn)eSO4·7H2O 100 mg，Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1200 μg，生物素100 μg，pH 7.0～7.2，0.75×105Pa滅菌 15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

活化斜面培養(yǎng):32℃恒溫培養(yǎng)24 h。

5 L種子罐(上海保興)培養(yǎng):吸取適量無菌生理鹽水于3支活化斜面中，將所有菌懸液接入裝5 L種子罐中，初始裝液量為3 L，初始通氣量3 L/min;攪拌轉(zhuǎn)速300～500 r/min;通過自動流加氨水控制pH 7.0;培養(yǎng)溫度37℃;以泡敵消泡;待種子培養(yǎng)液OD600值在10～20時，按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng):按10%接種量將種子液接入5 L發(fā)酵罐中;初始通氣量2 L/min;攪拌轉(zhuǎn)速500～800 r/min;通過自動流加氨水控制 pH 7.0;培養(yǎng)溫度32℃;以泡敵消泡;發(fā)酵過程中殘?zhí)墙抵烈欢ㄖ禃r，將80%葡萄糖溶液連續(xù)流加入培養(yǎng)基中。

1.4 分析方法

菌體生物量[5］:以菌體干重表示。取10 mL發(fā)酵液，10000 r/min離心20 min，將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平稱重。本文中所有數(shù)據(jù)均為3組平行實驗的平均值。

L-纈氨酸含量:采用高效液相分析系統(tǒng)測定。色譜分離條件:Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生測定，乙腈與NaAc溶液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫33℃，流動相流量1 mL/min，檢測波長360 nm。

乳酸及NH4+濃度:采用 BioProfile 300A Nova(Nova Biomedical，USA)生化分析儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同有機(jī)氮源對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

分別選取酵母膏、蛋白胨、酵母粉、豆餅水解液、玉米漿作為L-纈氨酸發(fā)酵的初始有機(jī)氮源，添加量為2 g/L(后兩者按20 mL/L計)，在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵60 h，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同有機(jī)氮源對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

由圖1可看出，不同有機(jī)氮源發(fā)酵時菌體的生物量和產(chǎn)酸有明顯差異。由圖1-A可以看出，使用玉米漿作為有機(jī)氮源時，菌體延滯期明顯縮短，4 h即進(jìn)入對數(shù)生長期，18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體在35 h達(dá)到最大生物量27.2 g/L，且在整個發(fā)酵過程中菌體沒有發(fā)生明顯衰退。而原始發(fā)酵工藝采用豆餅水解液作為有機(jī)氮源發(fā)酵時菌體的生長趨勢與前者大致相當(dāng)，其最大生物量為25.7 g/L，但菌體在50 h后發(fā)生明顯衰退。而酵母粉與蛋白胨作為有機(jī)氮源時，菌體的延滯期明顯延長，且菌體的最大生物量均明顯減小，分別為19.9 g/L和17.1 g/L，分別較以玉米漿作為有機(jī)氮源發(fā)酵時低26.3%和37.1%。就產(chǎn)酸而言，由圖1-B可知，使用玉米漿和豆餅水解液發(fā)酵時L-纈氨酸產(chǎn)量為45.2 g/L和41.7 g/L，酵母膏產(chǎn)量較前兩者低，為32.5 g/L，而使用酵母粉與蛋白胨發(fā)酵時產(chǎn)酸明顯降低，兩者產(chǎn)量僅為27.7 g/L和25.1 g/L。

由圖1可知，使用玉米漿作為有機(jī)氮源，對菌體生長和產(chǎn)酸最為有利，這是因為玉米漿是一種用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡水濃縮物，含有豐富的氨基酸、核酸、維生素、無機(jī)鹽等[6］，可以縮短菌體代謝過程，加快菌體生長，延長產(chǎn)酸期從而提高產(chǎn)率。此外，原始發(fā)酵工藝采用豆餅水解液雖然同樣能夠得到較高的菌體生物量及L-纈氨酸產(chǎn)量，但是其后期發(fā)酵無力，菌體衰退較快，另外，考慮到原料成本原因，確定玉米漿作為L-纈氨酸發(fā)酵的有機(jī)氮源。

2.2 玉米漿添加濃度對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

圖2為不同玉米漿濃度發(fā)酵時菌體耗糖速率變化曲線以及生物量、L-纈氨酸產(chǎn)量、副產(chǎn)物積累圖。由圖2可知，在發(fā)酵過程中，不同玉米漿濃度發(fā)酵時耗糖速率、菌體生物量、L-纈氨酸產(chǎn)量以及副產(chǎn)物積累均存在顯著差異。隨著玉米漿濃度的增加耗糖速率明顯增加(圖2-A)，但玉米漿添加濃度為35 mL/L與45 mL/L最大耗糖速率差異較小，分別為7.5 g/(L·h)和7.9 g/(L·h)，雖然前者達(dá)到最大耗糖速率較后者有所推遲，但前者在發(fā)酵中后期仍能維持較高的耗糖速率。

圖2 玉米漿添加濃度對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

由圖2-B可看出，隨著玉米漿濃度的增加，菌體生物量及發(fā)酵液中副產(chǎn)物丙氨酸和乳酸的積累量明顯增加。玉米漿添加濃度為45 mL/L時菌體最大生物量高達(dá)31.3 g/L，分別較前三者(最大生物量依次為19.8、22.4、28.5 g/L)提高了 36.7%、28.4% 和8.9%。而初始玉米漿濃度分別為15 mL/L和45 mL/L時，積累丙氨酸最大濃度依次為3.1 g/L和6.7 g/L，積累乳酸的最大濃度分別為0.6 g/L和3.1 g/L，這說明隨著初始玉米漿濃度升高，雖然能夠獲得更多的生物量，但是積累的副產(chǎn)物也急劇增加，這可能是因為當(dāng)玉米漿濃度升高時，發(fā)酵液中菌體濃度高，底物消耗增大，同時耗氧量增加，導(dǎo)致供氧不足從而使副產(chǎn)有機(jī)酸積累增多。

此外，在一定范圍內(nèi)，L-纈氨酸產(chǎn)量隨著玉米漿濃度的增加而增加，在玉米漿濃度為35 mL/L時達(dá)到最大產(chǎn)量52.0 g/L，而玉米漿添加濃度為45 mL/L時L-纈氨酸產(chǎn)量反而下降，為51.2 g/L，較前者下降1.5%。可以看出，一方面，隨著玉米漿濃度增加，菌體生物量及耗氧量大副增加，當(dāng)供氧不足時，葡萄糖降解通過三羧酸循環(huán)的氧化受到抑制，細(xì)胞內(nèi)丙酮酸水平提高，L-纈氨酸的合成前體增加，因而有利于L-纈氨酸的積累[7］;另一方面，玉米漿濃度過高時，造成乳酸和丙氨酸等代謝副產(chǎn)物大量生成并積累，降低細(xì)胞能量利用率，從而降低L-纈氨酸產(chǎn)量。

2.3 玉米漿濃度對耗氨速率及NH4+濃度的影響

在L-纈氨酸發(fā)酵過程中需要自動流加氨水來維持pH的穩(wěn)定，銨鹽可以作為發(fā)酵過程中的無機(jī)氮源和緩沖劑，但NH4+濃度過高，既會抑制菌體生長，易導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸、乳酸等有機(jī)酸大量生成，還可對代謝過程產(chǎn)生不利影響[8］。

圖3 玉米漿濃度對耗氨速率及濃度的影響

由圖3-A可看出，不同玉米漿添加濃度發(fā)酵時耗氨速率有較明顯差異。在發(fā)酵前期，隨著玉米漿濃度的增加，菌體的耗氨速率呈現(xiàn)加快趨勢?？梢钥闯?，當(dāng)玉米漿濃度為45 mL/L時，在24 h前能夠維持最高的耗氨速率，但發(fā)酵中后期耗氨速率明顯減緩，39 h達(dá)到最大速率45.5 mmol/(L·h)后，耗氨速率快速下降。同時，雖然玉米漿濃度為35 mL/L時在發(fā)酵前期耗氨速率較前者慢，但發(fā)酵中后期約24 h耗氨速率較前者加快，35 h即達(dá)到最大耗氨速率47.4 mmol/(L·h)，且后期耗氨速率下降趨勢明顯較前者減緩，這說明其在發(fā)酵后期菌體仍能夠維持較高的活力。此外，玉米漿濃度為15 mL/L和25 mL/L時，菌體耗氨速率明顯較前兩者緩慢，且在整個發(fā)酵過程中沒有出現(xiàn)明顯的耗氨高峰期，僅維持較低的耗氨速率至發(fā)酵結(jié)束。

2.4 玉米漿與生物素的混合使用

生物素又稱維生素H或輔酶R，生物素作為酶的輔助因子以多種方式參與微生物的代謝過程:參與丙酮酸脫羧反應(yīng);合成脂肪酸、蛋白質(zhì)和聚糖等;合成吡啶核酸、核苷酸，形成嘌呤核嘧啶的堿基[11］。在L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，生物素用量直接影響菌體生長、副產(chǎn)物積累及產(chǎn)酸量的高低[12］。生產(chǎn)上可作為生物素來源的原料有玉米漿、豆餅水解液、酵母以及糖蜜等。一般玉米漿中生物素含量相對較少，約180 μg/kg，若單獨添加玉米漿容易造成生物素供給不足，不利于菌體生長及L-纈氨酸生產(chǎn)，因此，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基(有機(jī)氮源為35 mL/L玉米漿或豆餅水解液)中添加 0、50、100、150、200 μg/L 的生物素，考察其對菌體生長和L-纈氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累等參數(shù)的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同生物素濃度下L-纈氨酸分批發(fā)酵過程參數(shù)比較

由表1可以看出，隨著生物素添加濃度的增加，菌體生物量明顯增加，副產(chǎn)物及L-纈氨酸產(chǎn)量均有不同程度增加，發(fā)酵周期也有一定程度縮短。生物素添加量為200 μg/L時，可獲得最大生物量34.6 g/L，生物量較不添加生物素時提高27.2%，同時發(fā)酵液中乳酸及丙氨酸含量也最高，糖酸轉(zhuǎn)化率卻最低;而生物素添加量為150 μg/L時可獲得最大L-纈氨酸產(chǎn)量50.6 g/L，較不添加生物素時提高25.8%，糖酸轉(zhuǎn)化率也相對較高。此外，與原始發(fā)酵工藝采用豆餅水解液相比，生物素添加量相同時，玉米漿作為有機(jī)氮源可以使生物量及產(chǎn)酸分別提高3.8%和7.3%。

在生物素充足時，丙酮酸的氧化速率雖然也有提高，但由于糖降解速率顯著提高，打破了糖降解速率與丙酮酸氧化速率之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應(yīng)，因而會引起乳酸的溢出[13］。因此，發(fā)酵過程中需控制合適的生物素含量，防止出現(xiàn)只長菌不產(chǎn)酸的現(xiàn)象，有效降低副產(chǎn)物的積累，這對提高糖酸轉(zhuǎn)化率及降低提取成本具有重要意義。

3 討論

影響L-纈氨酸產(chǎn)量的因素有很多，如菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等，控制合適的有機(jī)氮源及最佳初始添加濃度，對提高菌體生物量以及L-纈氨酸的產(chǎn)酸水平具有重要意義。Okamto等報道有機(jī)氮源中含有菌體生長必需的生長因子和微量元素，用量不當(dāng)會引起L-蘇氨酸產(chǎn)量20%～30%的波動[14］。玉米漿是一種用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡水濃縮物，含有豐富的氨基酸、核酸、維生素、無機(jī)鹽等，本文通過使用玉米漿替代豆餅水解液作為L-纈氨酸發(fā)酵的有機(jī)氮源，在降低原料成本的同時，使菌體生物量及產(chǎn)酸分別提高了3.8%和7.3%。

此外，在L-纈氨酸的發(fā)酵過程中有丙氨酸及乳酸等雜酸的積累，造成了碳源的浪費。秦永鋒等[15］通過在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2.0 g/L檸檬酸鈉，緩解了EMP途徑和TCA循環(huán)之間存在的“碳源溢流”，從而減少流向副產(chǎn)物(L-丙氨酸和HAc)的代謝流量，使L-纈氨酸生物合成途徑的代謝流量提高了10.7%。

L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，生物素用量直接影響菌體生長、副產(chǎn)物積累及產(chǎn)酸量的高低。如果生物素過量，容易造成菌體大量繁殖，易產(chǎn)生副產(chǎn)物乳酸及琥珀酸，從而降低產(chǎn)酸及糖酸轉(zhuǎn)化率。若生物素低則容易導(dǎo)致菌體生長慢，耗糖慢，發(fā)酵周期長，易染菌等現(xiàn)象，同樣不利于L-纈氨酸發(fā)酵的順利進(jìn)行。本文考察了玉米漿與生物素不同配比對L-纈氨酸分批發(fā)酵過程的影響后，確定了最適生物素添加濃度，較原始發(fā)酵工藝(豆餅水解液，表1)相比，最終使菌體生物量及產(chǎn)酸提高了13.2%和18.5%，同時在一定程度上縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，這對工業(yè)化生產(chǎn)降低發(fā)酵成本具有重要意義。

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ABSTRACTThe effects of organic nitrogen sources on the fermentation of L-valine were studied with L-valine-producing strain Corynebacterium glutamicum XV0505.Corn steep liquor was selected as the appropriate nitrogen source instead of soybean hydrolysates to reduce the cost of fermentation.The effects of initial concentration of corn steep liquor in fermentation process on biomass，glucose consumption rate，yield of L-valine，accumulation of byproduct and ammonia consumption rate were studied by carrying out fed-batch fermentation.The optimal initial concentration of corn steep liquor was also determined.The effects of the combined agents，biotin and corn steep liquor，on overproduction of L-valine were also studied，and the concentration of biotin was optimized.Compared with those of the original process，the biomass and L-valine production from the improved process were increased by 13.2%and 18.5%respectively.

Key wordsorganic nitrogen，L-valine，corn steep liquor，biotin

The Effects of Organic Nitrogen Sources on the Fermentation of L-valine by Corynebacterium glutamicum

Xu Qing-yang，Sun Jia-kai，Wu Xiao-jiao，Wang Jing，Xie Xi-xian，Chen Ning
(College of Biological Engineering，Tianjin University of Science＆ Technology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin 300457，China)

助理研究員(陳寧教授為通訊作者)。

*國家科技重大專項(2008ZX09401-05);天津市科技支撐計劃重點項目(08ZCKFSH01900)

2011-12-09，改回日期:2012-03-01