超聲波提取縊蟶多糖及脫蛋白工藝

許靜

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東威海264209）

超聲波提取縊蟶多糖及脫蛋白工藝

許靜

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東威海264209）

采用超聲波法對(duì)縊蟶多糖進(jìn)行了提取，正交試驗(yàn)確定了最佳提取工藝條件：超聲功率440 W，提取時(shí)間60 min，提取溫度80℃，料液比1∶30（g/mL）。在此條件下，縊蟶粗多糖提取率為8.31%。對(duì)比了Sevag法和三氯乙酸法對(duì)縊蟶粗多糖脫蛋白的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三氯乙酸法在蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率兩個(gè)方面的綜合指標(biāo)較理想，三氯乙酸法處理3次后，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到69.75%，縊蟶多糖損失率為26.68%。

縊蟶；多糖；提??；脫蛋白

Abstract:In this paper the polysaccharide was extracted from the Sinonov acula constricta by ultrasoundassisted method.The optimum conditions obtained by the orthogonal test as follow：ultrasonic power 440 W,ultrasonic extraction time 60 min,extraction temperature 80 ℃ and material to water ratio 1∶30(g/mL).With these conditions,the highest extracting amount of polysaccharide reached to 8.31%.The effect of deproteinization was evaluated through the comparation of the Sevaq method and the trichloroacetic acid （TCA）method.The experimental results indicate that the TCA method has the higher deproteinization rate and lower polysaccharides loss rate.For 3 times of deproteinization by TCA method，the results were：the deproteinization rate 69.75%and the polysaccharides loss rate 26.68%.

Key words：Sinonov acula constricta；polysaccharide；extraction；deproteinization

多糖是構(gòu)成生命的重要基本物質(zhì)之一，具有促進(jìn)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗放射性、抗衰老等多種活性[1-2]。隨著對(duì)多糖研究的深入，海洋生物多糖越來越引起人們的關(guān)注。徐紅麗等從貽貝中分離出一種具有抗腫瘤活性的多糖[3]，王長云等從海灣扇貝邊中提取分離出一種具有顯著抗凝血活性的氨基多糖[4]。研究表明貝類多糖是貝類體內(nèi)一種含量豐富的生物活性物質(zhì)[5]，具有較高的開發(fā)價(jià)值。

縊蟶（Sinonov acula constricta），俗稱蟶子，屬軟體動(dòng)物，系瓣鰓綱，真瓣鰓且、竹蟶科，廣泛分布于我國沿海地區(qū)，是一種大眾化的海產(chǎn)食品。中醫(yī)認(rèn)為，縊蟶肉具有有清熱解毒、補(bǔ)陰除煩、益腎利水[6]等作用。目前，縊蟶主要用于食用，對(duì)其所含生物活性物質(zhì)的研究鮮有報(bào)道，本文對(duì)縊蟶肉多糖的提取及脫蛋白工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為縊蟶的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)的研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

縊蟶：購于威海水產(chǎn)市場；硫酸、苯酚、乙醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷等所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1電動(dòng)組織搗碎機(jī)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；TDL-60離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：上海比朗儀器有限公司；FD-1D冷凍真空干燥機(jī)：上海精密儀器儀表有限公司；UV-2000紫外-可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 縊蟶多糖的提取

新鮮縊蟶去殼后用水進(jìn)行清洗瀝干，組織絞碎機(jī)打碎，浸泡于丙酮中4℃過夜脫脂，瀝干備用。稱取一定量縊蟶粉碎組織，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中浸提，以超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度、料液比為可變因素，在不同條件下進(jìn)行超聲提取[7]。提取液離心取上清減壓抽濾，加入3倍體積的95%乙醇，減壓抽濾、真空冷凍干燥即得縊蟶多糖。

1.3.2 多糖含量的測定

采用苯酚－硫酸比色法測定多糖的含量[8]。準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，定容至500 mL。各吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分別加入試管，并以水補(bǔ)至1.0 mL，加入5%的苯酚1mL，再加入濃硫酸5 mL，混勻后，沸水浴加熱30 min，冷卻后于490 nm處測定吸光度（OD）。橫坐標(biāo)為吸光度值，縱坐標(biāo)為葡萄糖濃度，得到回歸方程Y=0.654X-0.0076，R2=0.9986。取1.0 mL多糖樣品溶液,依標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定其多糖含量。

1.3.3 縊蟶多糖的脫蛋白

以蛋白脫除率、縊蟶多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比Sevag法、三氯乙酸法對(duì)粗多糖脫蛋白的影響[9]。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測粗多糖中蛋白含量，苯酚-硫酸法檢測多糖含量。Sevag法脫蛋白：取100 mL濃度為10.0 mg/mL縊蟶多糖水溶液，加1/3體積的Sevag試劑，攪拌30 min，靜置分離，收集上層縊蟶多糖水溶液，取樣測量并計(jì)算其蛋白質(zhì)和多糖含量，反復(fù)處理8次；三氯乙酸法脫蛋白：取100 mL濃度為10.0 mg/mL縊蟶多糖水溶液6份，加入20%三氯乙酸溶液至溶液終濃度為 5%，攪拌 30 min，4℃靜置 12 h，4000 r/min離心5 min，收集上層縊蟶多糖水溶液，取樣測量并計(jì)算其蛋白質(zhì)和多糖含量，反復(fù)處理6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 縊蟶多糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)多糖提取量的影響

在料液比為 1∶30（g/mL）、溫度為 50 ℃、提取時(shí)間60 min的條件下提取，研究不同的超聲功率200、280、360、440、520、600 W對(duì)縊蟶多糖提取效果的影響，計(jì)算提取率，比較不同超聲功率多糖的提取率見圖1。

如圖1可知，多糖的提取率隨著超聲波功率的升高而增加，當(dāng)功率達(dá)到440 W時(shí)，縊蟶多糖提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大功率，多糖提取率有所降低。這可能是因?yàn)槌暡ǖ摹翱栈?yīng)”產(chǎn)生的細(xì)胞破壁作用提高了多糖的浸出率，從而使多糖的得率提高。當(dāng)超聲波功率過高時(shí)可能破壞了多糖分子的結(jié)構(gòu)，使多糖降解，反而使多糖得率降低，因此初步確定最佳超聲功率為440 W。

2.1.2 對(duì)多糖提取量的影響

在料液比為 1∶30（g/mL）、溫度為 50 ℃、超聲功率440 W的條件下提取，研究不同的超聲時(shí)間20、40、60、80、100、120 min對(duì)縊蟶多糖提取效果的影響，計(jì)算提取率，比較不同超聲時(shí)間多糖的提取率見圖2。

如圖2所示，酶解時(shí)間由20 min增加到60 min，多糖提取率顯著提高。超過60 min后，多糖的提取率反而有所下降。這可能是超聲長時(shí)間的作用對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞，導(dǎo)致多糖降解，因此初步確定超聲提取最佳時(shí)間為60 min。

2.1.3 對(duì)多糖提取量的影響

在料液比為 1∶30（g/mL）、超聲時(shí)間 60 min、超聲功率440 W的條件下提取，研究不同的提取溫度30、40、50、60、70、80℃對(duì)縊蟶多糖提取效果的影響，計(jì)算提取率，比較不同超聲時(shí)間多糖的提取率見圖3。

如圖3所示，多糖的提取量隨溫度的升高而顯著增加，說明在30℃～80℃范圍內(nèi)，溫度越高對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用越強(qiáng)，越有利于胞內(nèi)物質(zhì)的浸出，因此初步確定最佳提取溫度應(yīng)在80℃左右。

2.1.4 料液比對(duì)多糖提取量的影響

在超聲時(shí)間60 min、超聲功率440 W、提取溫度80 ℃的條件下提取，研究不同的料液比 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）對(duì)縊蟶多糖提取效果的影響，計(jì)算提取率，比較不同超聲時(shí)間多糖的提取率見圖4。

由圖 4 所示，料液在比 1∶20～1∶30（g/mL）時(shí)，多糖的提取量隨著液料比的增加明顯提高，料液比大于1∶30（g/mL）時(shí)，多糖的提取率增加緩慢?？紤]液體過多導(dǎo)致濃縮時(shí)浪費(fèi)能源，綜合考慮最佳料液比為1∶30（g/mL）。

2.2 多糖提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度、料液比4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以獲取最佳試驗(yàn)條件。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Polysaccharide extracting rate of orthogonal test

正交試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，各因素的影響次序?yàn)椋禾崛囟龋咎崛r(shí)間＞料液比＞超聲功率。由表中可以看出，最佳組合因素為A2B2C3D1，即超聲功率為440 W，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為80℃，料液比為1∶30（g/mL），試驗(yàn)結(jié)果多糖得率為8.31%。因此,確定縊蟶多糖提取的最佳工藝條件為A2B2C3D1。

2.3 Sevag法與三氯乙酸法脫蛋白效果

2.3.1 Sevag法脫蛋白的效果

Sevag法脫蛋白對(duì)蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率的影響見圖5。

由圖5可以看出，隨著Sevag法脫蛋白次數(shù)的增加，縊蟶多糖溶液中蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加，而多糖損失率也在逐漸增加，處理5次后，蛋白質(zhì)脫除率增加的幅度放緩。處理5次后蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到62.76%，而多糖損失率為34.35%。Sevag法脫蛋白需重復(fù)多次，效率較低，并且縊蟶多糖的損失量較大，同時(shí)有機(jī)溶劑的大量使用也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，綜合考慮以上因素，Sevag法不適合縊蟶多糖的脫蛋白處理。

2.3.2 三氯乙酸法脫蛋白的效果

三氯乙酸法脫蛋白對(duì)蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率的影響見圖6。

由圖6可以看出，三氯乙酸法脫蛋白處理3次后，蛋白脫除率為69.75%，多糖損失率為26.68%，較Sevag法相比，三氯乙酸法操作次數(shù)少，蛋白脫除率效率高，多糖損失率較低，效果優(yōu)于Sevag法。

3 結(jié)論

縊蟶多糖的提取最佳工藝條件為：超聲功率440W，提取時(shí)間 60 min，提取溫度 80 ℃，料液比 1∶30（g/mL），縊蟶粗多糖得率為8.31%。

采用Sevag法和三氯乙酸法對(duì)縊蟶粗多糖脫蛋白，結(jié)果表明：Sevag法需重復(fù)多次，效率低；三氯乙酸法在蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率兩個(gè)方面的綜合指標(biāo)較理想，三氯乙酸法處理3次后，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到69.75%，縊蟶多糖損失率為26.68%。

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Study on the Extraction Technology with Ultrasound-assisted and Deproteinization Technology of Polysaccharide from Sinonov Acula Constricta

XU Jing
（College of Marine Science,Harbin Institute of Technology at Wei Hai,Weihai 264209，Shandong,China）

2011-12-29

許靜（1973—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。