鹿茸水提物模擬胃腸消化物對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

趙 磊，籍保平，王成濤

（1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

鹿茸水提物模擬胃腸消化物對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

趙 磊1，籍保平2，*，王成濤1

（1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

研究鹿茸水提取物模擬胃腸消化物（AEVA-SGD）的分離組分對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。AEVA-SGD的分離采用凝膠層析法和RP-HPLC法。應(yīng)用WST-8法檢測各分離組分對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用高分辨質(zhì)譜對有效分離組分進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果顯示，AEVA-SGD經(jīng)Sephadex LH-20分離后得到6個組分（A～F）。其中，組分F對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響最為顯著，可單獨促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，但對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用。經(jīng)RPHPLC將組分F分為3個部分，初步鑒定組分F1為鳥嘌呤，F(xiàn)2為1-甲基鳥嘌呤和黃嘌呤，F(xiàn)3為多種小肽的混合物。組分F3對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響最大，組分F對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響是其各分離組分協(xié)同作用的結(jié)果。

鹿茸水提取物，模擬胃腸消化物，分離，小鼠脾細(xì)胞，免疫

Abstract：The aim of the present study was to investigate the effect of fractions from simulated gastrointestinal digest of aqueous extract of velvet antler（AEVA-SGD） on murine splenocytes proliferation.AEVA-SGD was fractionated by gel chromatography and RP-HPLC consecutively.The effect of each fraction on the proliferation of murine splenocytes was detected by WST-8.The effective fractions were preliminary identified by high resolution mass spectrometry.The results showed that AEVA-SGD was separated into six fractions（A～F） by Sephadex LH-20.Fraction F（Fr.F） stimulated the proliferation of resting murine splenocytes，whereas inhibited the proliferation of ConA-stimulated murine splenocytes.The effect of Fr.F on the proliferation of murine splenocytes was more effective than the other fractions.After separation by RP-HPLC，F(xiàn)r.F was fractionated into three parts.The main components of each part were preliminary identified as：guanine（Fr.F1），1-methylguanine and xanthine（Fr.F2），a mixture of small peptides（Fr.F3）.Compared with Fr.F1 and Fr.F2，the effect of Fr.F3 on the proliferation of murine splenocyte was more effective.The total effect of Fr.F on the proliferation of murine splenocyte was due to the synergistic effects of its fractions.

Key words：aqueous extract of velvet antler；simulated gastrointestinal digest；separation；murine splenocyte；immunity

鹿茸為鹿科動物的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，與人參、靈芝、冬蟲夏草和阿膠并稱為中華養(yǎng)生五大圣品。鹿茸具有生精補髓、養(yǎng)血益陽、強筋健骨、延年益壽等功效，常用于功能性食品和保健品。鹿茸水提取物是鹿茸最為廣泛的食用形式之一[1-2]?，F(xiàn)代研究證實，鹿茸水提取物具有強壯機體、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抗衰老和抗氧化等作用[3-8]。隨著人們的生活水平和健康意識不斷提高，亞健康狀態(tài)引起人們的關(guān)注，其最本質(zhì)的問題是人體自身免疫功能失調(diào)。通過免疫調(diào)節(jié)改善自身免疫狀況，是人們遠(yuǎn)離亞健康的最理想方法。因此，以鹿茸水提取物的免疫調(diào)節(jié)作用作為研究的切入點具有重要意義。金光湖等[9]報道鹿茸水提取物可增強遲發(fā)性免疫反應(yīng)，增加脾細(xì)胞中玫瑰花結(jié)細(xì)胞的數(shù)量，并顯著提高綿羊紅細(xì)胞的凝集素值和溶血素值，從而促進(jìn)機體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。然而，Kim等[10]報道鹿茸水提取物體外能夠抑制抗原刺激的T細(xì)胞活化，并在高濃度下降低巨噬細(xì)胞的吞噬作用，具有免疫抑制作用。可見，鹿茸水提取物對免疫系統(tǒng)可能具有雙向調(diào)節(jié)作用，但具體何種成分發(fā)揮作用尚缺乏系統(tǒng)研究。為探討鹿茸水提取物食用后經(jīng)胃腸消化降解成何種成分發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，前期研究通過體外模擬胃腸消化模型，探討鹿茸水提取物在消化過程中免疫調(diào)節(jié)活性的變化。結(jié)果顯示，經(jīng)模擬胃腸消化，鹿茸水提取物對未經(jīng)絲裂原誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用消失，對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用增強[5，11]，但具體原因以及活性成分還有待進(jìn)一步闡明。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用凝膠層析和RP-HPLC法將鹿茸水提取物模擬胃腸消化物進(jìn)行分離，評價各分離組分對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響，并對有效分離組分進(jìn)行了初步鑒定，旨在探討其免疫調(diào)節(jié)活性及功能成分，為進(jìn)一步的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鹿茸凍干超微粉 由東北大興安嶺區(qū)科技局提供；SPF級Balb/c小鼠（合格證號：SCXK-（軍）2007-004），6～8周齡，雄性 購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；胃蛋白酶、胰酶、刀豆蛋白A（ConA） 購自美國Sigma化學(xué)公司；Sephadex LH-20 購自安瑪西亞生物科技有限公司；乙腈（色譜純） 購自美國Fisher公司；甲酸（色譜純）和三氟乙酸 購自北京化學(xué)試劑公司；RPMI-1640高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、紅細(xì)胞裂解液、臺盼蘭、Hepes和CCK-8試劑盒 均購自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清 購自杭州四季青生物工程材料有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

DBS-100電腦全自動部分收集器和DHL-A電腦恒流泵 上海滬西分析儀器廠；Cintra 6紫外可見分光光度計 澳大利亞GBC科學(xué)儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；XDOS-1B倒置生物顯微鏡 重慶光電有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本SANYO公司；Multiskan MK3自動酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機 湘儀離心機廠；MLS2420/2420U全自動殺菌釜 日本SANYO公司；SHIMADZU LC-10A高效液相色譜儀 日本島津公司；電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀micrOTOF-Q II 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿茸水提取物模擬胃腸消化物（AEVA-SGD）的制備 鹿茸水提取物的制備：稱取50g鹿茸超微粉，加入1000mL蒸餾水，沸水浴提取2h，過濾收集提取液，殘渣用蒸餾水繼續(xù)提取2次，每次2h，合并提取液，60℃減壓濃縮，冷凍干燥得鹿茸水提取物凍干粉19.3g，經(jīng)計算水提取物得率為38.5%。

AEVA-SGD的制備：采用文獻(xiàn)[6]報道方法制備鹿茸水提取物模擬胃腸消化物。先用胃蛋白酶水解2h，再用胰酶繼續(xù)水解4h，隨后用1mol/L NaOH將pH調(diào)至7.0，沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫后，于4℃10000r/min離心20min。冷凍干燥后粉末于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AEVA-SGD的凝膠層析分離 稱取Sephadex LH-20凝膠干粉加入過量的水，沸水浴浸泡3h，多次浮選去未沉淀細(xì)顆粒，洗脫液平衡1h，減壓抽氣除去氣泡。凝膠預(yù)處理好后裝柱，柱體積為1cm×70cm，凝膠沉積到柱的頂端約5cm處停止裝柱，3～5倍體積的洗脫液平衡層析柱。

將AEVA-SGD凍干粉溶于超純水，濃度為200mg/mL，用吸管將樣品滴加到凝膠床面上，上樣量1mL，待樣品流至床表面，用少量超純水同樣小心清洗表面1次，然后在柱內(nèi)加滿超純水，鏈接恒壓泵、層析柱、主動收集器，以超純水洗脫，流速1mL/min，用自動收集器按每管3mL收集洗脫流出液，于254nm波長檢測吸光值，合并同一分離峰的洗脫液，冷凍干燥后于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 AEVA-SGD的高效液相色譜分離 采用RPHPLC技術(shù)分離分析經(jīng)Sephadex LH-20層析柱分離后的活性組分。

色譜條件：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm，80魡），樣品濃度10mg/mL，上樣量10μL，流速0.8mL/min，檢測波長215nm，柱溫30℃，流動相A相：含0.1%TFA的乙腈，B相：含0.1%TFA的水，梯度條件：0～5%A，0～10min；5～50%A，10～30min；50～0%A，30～32min；0%A，32～40min。

1.2.4 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備 將小鼠（Balb/c）拉頸處死，無菌分離完整脾臟，用PBS沖去浮血，剝除結(jié)締組織及脂肪成分。脾組織剪碎后置于小燒杯上的200目不銹鋼濾網(wǎng)上，用注射器針芯研磨，PBS液洗滌，用吸管收集沖洗液至離心管，1200r/min離心5min，棄上清液，加入3mL紅細(xì)胞裂解液，靜置2min，加入10mL PBS終止反應(yīng)，1200r/min離心5min，棄上清。用PBS液洗兩次，不完全RPMI-1640洗一次，加適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10mmol/L Hepes）重懸細(xì)胞。調(diào)整濃度至2×106個細(xì)胞/mL，臺盼蘭染色測細(xì)胞存活率大于95%。

1.2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖實驗 將上述脾細(xì)胞懸液按100μL/孔加入到96孔培養(yǎng)板中，再添加10μL ConA（終濃度為5μg/mL）或不添加ConA 10μL樣品溶液，每個處理設(shè)6個復(fù)孔。同時做正常對照組和ConA對照組，正常對照組為100μL脾細(xì)胞懸液，ConA對照組是在100μL細(xì)胞懸液中添加10μL ConA（終濃度為5μg/mL）。然后將培養(yǎng)板置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

1.2.6 細(xì)胞增殖程度的測定及計算分析 本實驗選用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞增殖程度。結(jié)果用刺激指數(shù)（Simulation index，SI）表示，公式如下：

1.2.7 AEVA-SGD主要活性成分的液質(zhì)聯(lián)用分析HPLC條件：Agilent ZORBAX SB-C18（2.1mm×150mm，5μm）；流速0.3mL/min，檢測波長260nm，柱溫30℃；流動相A相：0.1%甲酸水溶液，B相：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫條件同1.2.3。

micrOTOF-Q II四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀。電噴霧離子源（ESI）噴射電壓為4.5kV；正離子模式；噴霧壓力為0.6bar；干燥氣（N2）流速為7L/min，溫度為180℃；離子掃描范圍為20～1000m/z。

1.2.8 統(tǒng)計分析 每個實驗重復(fù)六次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示，采用組間t檢驗，p＜0.05具有顯著性差異，p＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 Sephadex LH-20柱分離AEVA-SGD

Sephadex LH-20的分離以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用。如果使用正相溶劑洗脫，則主要靠凝膠過濾作用來分離。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，最后出柱。將AEVA-SGD用Sephadex LH-20凝膠層析進(jìn)行分離，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯鯝EVA-SGD依照分子量大小主要被分成6個主要組分（A～F）。將各段的洗脫液按圖中所示收集冷凍干燥后，測定各組分對小鼠脾細(xì)胞增殖能力的影響。

圖1 鹿茸水提取物模擬胃腸消化物的Sephadex LH-20凝膠層析譜圖Fig.1 Gel filtration chromatography of AEVA-SGD on a sephadex LH-20 column

2.2 Sephadex LH-20分離所得組分對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

本研究通過各分離組分體外對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響來評價其免疫調(diào)節(jié)作用。Sephadex LH-20分離所得組分對未經(jīng)ConA和經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響如圖2～圖3所示。

由圖2可知，當(dāng)濃度≤200μg/mL時，組分A，B，C和E單獨對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響不顯著（p＞0.05）。僅在400μg/mL時，組分C才對小鼠脾細(xì)胞增殖有抑制作用，而組分E對小鼠脾細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用（p＜0.05）。組分D和F在濃度達(dá)到1μg/mL時即可促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，隨著濃度的升高，SI（不含ConA）值逐漸增大；當(dāng)濃度達(dá)到100μg/mL時，組分D和F的SI（不含ConA）值達(dá)到最大，分別為1.089和1.166，濃度繼續(xù)升高，SI（不含ConA）值開始減小；當(dāng)濃度升高至400μg/mL時，組分F對小鼠脾細(xì)胞增殖表現(xiàn)出抑制作用，其SI（不含ConA）值為0.959，推測其在高濃度時可能具有微弱的細(xì)胞毒性，從而對小鼠脾細(xì)胞增殖表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制的劑量效應(yīng)。

圖2 Sephadex LH-20分離所得組分對小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of fractions separated by sephadex LH-20 on the proliferation of murine splenocytes.

ConA是T淋巴細(xì)胞的有絲分裂原，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，進(jìn)而使細(xì)胞因子合成、細(xì)胞因子受體表達(dá)、細(xì)胞分化及細(xì)胞增殖等變化。機體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量越大，增殖活性越高，機體由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能越強[12]。組分A～F對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖如圖3所示。各組分均不同程度的顯示出對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖的抑制作用，其中以組分F的作用最強。在50、400μg/mL時，組分F的SI（ConA）值分別為2.388和1.041，對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到了11.9%和61.6%。因此，推測食用鹿茸水提取物可抑制過度的自身免疫反應(yīng)，幫助人們對抗類風(fēng)濕等自身免疫疾病，這與鹿茸緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的功能是一致的[10，13]。在400μg/mL時，組分F對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖具有高抑制率，可能與其本身在此濃度時有微弱的細(xì)胞毒性有關(guān)。絕大多數(shù)研究表明，在加入樣品的同時加入ConA，樣品的免疫調(diào)節(jié)活性較大。本研究結(jié)果顯示，AEVA-SGD分離組分與ConA同時加入，淋巴細(xì)胞增殖受到強烈抑制。分析原因有：樣品本身對T淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用；樣品影響了淋巴細(xì)胞對ConA的敏感性或是樣品預(yù)先與淋巴細(xì)胞膜上的ConA受體相結(jié)合，使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中斷，從而抑制了細(xì)胞的活化和增殖。具體原因有待進(jìn)一步探討，后續(xù)實驗可采取先加樣品再加ConA的順序進(jìn)行驗證。

圖3 Sephadex LH-20分離所得組分對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of fractions separated by sephadex LH-20 on ConA-stimulated proliferation of murine splenocytes

依據(jù)各分離組分對未經(jīng)ConA和經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖實驗結(jié)果，可知組分F作用效果明顯，因此選擇組分F（AEVA-SGD-F）用作后續(xù)研究。

2.3 RP-HPLC分離AEVA-SGD-F

RP-HPLC利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑（如甲醇、乙腈等）或其水溶液作為流動相，根據(jù)物質(zhì)疏水性的差別進(jìn)行分離純化。正常情況下，疏水性弱的物質(zhì)先被洗脫下來，疏水性強的物質(zhì)后被洗脫下來。由于RP-HPLC的樣品處理量較少，通常將其作為最后一步分離手段。

AEVA-SGD-F通過RP-HPLC分離，將色譜峰分為3個部分，如圖4所示。將這3部分分別以F1、F2和F3表示。組分F1極性很強，在C18柱上保留時間很短；組分F2由兩個主要的色譜峰組成；組分F3由許多很小的色譜峰組成，且洗脫時所用乙腈濃度較F1和F2高，表明F3相對含有較多的疏水性成分。

圖4 AEVA-SGD-F的RP-HPLC圖譜Fig.4 RP-HPLC chromatogram of AEVA-SGD-F

2.4 RP-HPLC分離所得組分對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

各分離組分對未經(jīng)ConA誘導(dǎo)和ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的影響見圖5。由圖5（A）可知，在100和200μg/mL時，AEVA-SGD-F各分離組分本身均對小鼠脾細(xì)胞增殖無影響（p＞0.05）。我們推測，在100μg/mL時，AEVA-SGD-F本身對小鼠脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用是其各分離組分協(xié)同作用的結(jié)果。

圖5 RP-HPLC分離所得組分對未經(jīng)ConA和經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.5 Effect of fractions separated by RP-HPLC on the proliferation of murine splenocytes with or without induction of ConA

由圖5（B）可知，在100和200μg/mL時，AEVASGD-F各分離組分均可顯著抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖（p＜0.05），尤以高濃度時明顯。各分離組分對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的抑制作用的強弱順序為：F3＞F2＞F1。低、高濃度的F3對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到了49.2%和65.7%。

2.5 AEVA-SGD-F成分的初步鑒定

AEVA-SGD-F成分的HPLC-ESI-HRMS分析見表1。結(jié)合已報道鹿茸中存在的成分[14]以及質(zhì)譜結(jié)果，初步鑒定AEVA-SGD-F1的主要成分為鳥嘌呤；AEVA-SGD-F2的主要成分為1-甲基鳥嘌呤和黃嘌呤。AEVA-SGD-F3經(jīng)HPLC-ESI-HRMS分析檢測到20個主峰，分子量在200～600u之間，推測其為多種小肽的混合物。

表1 AEVA-SGD-F主要成分的正離子HRMS分析Table 1 Positive ion HRMS analysis of main compounds in AEVA-SGD-F

3 結(jié)論

本研究通過體外模擬胃腸消化模型制備AEVASGD，探討鹿茸水提取物食用后經(jīng)胃腸消化降解成何種成分發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。采用凝膠層析和RP-HPLC法將AEVA-SGD進(jìn)行分離，評價各分離組分對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響，并對有效分離組分進(jìn)行了初步鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)Sephadex LH-20分離后得到一種活性組分F，可單獨促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，但對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用，組分F的各成分間協(xié)同作用，初步鑒定為嘌呤和小肽的混合物。本研究提示食用鹿茸水提取物可能抑制過度的自身免疫反應(yīng)，幫助人們對抗類風(fēng)濕等自身免疫疾病。

[1]鞏振東，李翠娟，趙景軍.鹿茸——走進(jìn)中藥[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2004：41-51.

[2]趙磊，王成濤，籍保平.鹿茸水提取物及其蛋白酶解物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響[J].北京工商大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，29（3）：20-27.

[3]Percival RS.Examining the effects of deer antler velvet supplementation on muscular strength，performance，and markers of delayed onset muscle soreness[D].Tennessee：East Tennessee State University，2005.

[4]張睿，趙玉紅，王忠政.鹿茸水提物對小鼠抗疲勞功能的影響[J].食品工業(yè)科技，2011，32（4）：365-367.

[5]Zhao L，Ji BP，Li B，et al.Immunomodulatory effects of aqueous extract of velvet antler（Cervus elaphus Linnaeus） and its simulated gastrointestinal digests on immune cells in vitro[J].Journal of food and drug analysis，2009，17（4）：282-292.

[6]Wang BX，Zhao XH，Qi SB，et al.Effect of repeated administration of deer antler extract on biochemical changes related to aging in senescence accelerated mice[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1988，36（7）：2587-2593.

[7]Zhao L，Pei RS，Ji BP，et al.Antioxidant activity of aqueous extract fractions of velvet antler（Cervus elaphus Linnaeus）[J].Journal of Food Drug Analysis，2010，18（5）：319-327.

[8]Mikler JR，Theoret CL，High JC.Effects of topical elk velvet antler on cutaneous wound healing in streptozotocin-induced diabeticrats[J].JournalofAlternative and Complementary Medicine，2004，10（5）：835-840.

[9]金光湖，崔平洛.鹿茸對氨甲喋呤引發(fā)的免疫功能低下的影響[J].黑龍江中醫(yī)藥，1993（2）：40-42.

[10]Kim YK，Kim KS，Chung KH，et al.Inhibitory effects of deer antler aqua-acupuncture，the pilose antler of Cervus korean TEMMINCK var.mantchuricus Swinhoe，on type II collageninduced arthritis in rats[J].International Immunopharmacology，2003（3）：1001-1010.

[11]趙磊.鹿茸水提取物的特征成分及蛋白質(zhì)功能研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[12]朱力平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實驗方法[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：151-190.

[13]Kang KS，Kim KS，Kim SI，et al.Immunosuppressive activity of deer antler extracts of Cervus korean TEMMINCK var.mantchuricus Swinhoe，on type II collagen-induced arthritis in rats[J].In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal，2006，42（3/4）：100-107.

[14]范玉林.鹿茸化學(xué)成分研究概述[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1980（1）：72-78.

Effect of simulated gastrointestinal digest of aqueous extract of velvet antler on murine splenocytes proliferation

ZHAO Lei1，JI Bao-ping2，*，WANG Cheng-tao1
（1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

TS201.4

A

1002-0306（2012）16-0350-05

2012－01－11 *通訊聯(lián)系人

趙磊（1982-），女，博士，講師，主要從事功能性食品研究。

北京市教育委員會科技計劃面上項目（KM201210011008）。