響應(yīng)面法優(yōu)化仿栗籽蛋白提取工藝

黃 偉，麻成金，*，黃 群，蘇 超，馮 磊

（1.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首416000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首416000）

響應(yīng)面法優(yōu)化仿栗籽蛋白提取工藝

黃 偉1，2，麻成金1，2，*，黃 群2，蘇 超2，馮 磊2

（1.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首416000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首416000）

研究了仿栗籽蛋白的堿溶酸沉法提取工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定提取溫度、pH、提取時(shí)間、液料比四個(gè)因素的三個(gè)水平進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，建立了仿栗籽蛋白提取率的二次回歸方程，通過(guò)響應(yīng)面分析以及嶺嵴分析得到了優(yōu)化組合條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取工藝條件為pH9.6、溫度42℃、時(shí)間138min、料液比1∶25（g/mL）時(shí)，仿栗籽蛋白提取率為64.97%。

仿栗籽蛋白，堿提酸沉，響應(yīng)面法，提取工藝

Abstract：The extraction of protein from the sloanea hemsleyana seed by alkaline extraction and acid precipitation was studied.According to the single-factor experiments，three levels of the factors（extraction temperature，extraction time，pH and material/liquid ratio） were selected for the central composite design to establish a quadric regression equation for describing the yield of sloanea hemsleyana seed protein.By response surface analysis，the optimum extraction conditions were obtained as follows：extraction temperature of 42℃，time of 138min，pH9.6 and material/liquid ratio of 1∶25（g/mL），under which the highest yield of sloanea hemsleyana seed protein reached 64.97%.

Key words：sloanea hemsleyana seed protein；alkaline extraction and acid precipitation；response surface methodology；extraction process

仿栗（Sloanea hemsleyana（Ito）Rehd.et Wils）系杜英科猴歡喜屬常綠喬木，生長(zhǎng)在海拔500～1400m的山谷林中，國(guó)內(nèi)主要分布于南亞熱帶至中亞熱帶的湘、鄂、川、滇、黔、桂等地區(qū)，國(guó)外僅越南等部分東南亞國(guó)家有分布[1-2]。湖南省湘西、湘北地區(qū)分布有大面積的野生仿栗混交林和散生林，目前我國(guó)一些地區(qū)已建立了一定規(guī)模的仿栗人工林基地，仿栗資源豐富[3]。仿栗籽是仿栗果實(shí)脫殼去假種衣后得到的種仁，其含油率最高可達(dá)58%，可以用來(lái)制備生物柴油原料油和高級(jí)食用植物油，脫脂后的籽粕還含有豐富的蛋白質(zhì)（約為20%～25%），具有較高的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值[2-3]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于仿栗的研究主要集中在對(duì)其生物學(xué)特性及果實(shí)油脂的提取與應(yīng)用等方面，尚未見(jiàn)相關(guān)仿栗籽蛋白的研究報(bào)道[3]。本實(shí)驗(yàn)以仿栗籽粕為研究對(duì)象，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)堿溶酸沉法提取仿栗籽蛋白的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為仿栗籽的綜合開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仿栗籽粕 2011年10月初采摘于吉首大學(xué)新校區(qū)內(nèi)，常溫脫脂后過(guò)60目篩，蛋白質(zhì)21.27%；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)（分析純） 美國(guó)AMRESCO公司；透析袋（分子截留量8000～14000） 美國(guó)Sigma公司；石油醚、鹽酸、氫氧化鉀、五水硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、硫酸、磷酸等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

CDE-220E2多功能食品處理機(jī) 佛山市順德區(qū)歐科電器有限公司；JA5103N高精度電子天平、721分光光度計(jì) 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器 金壇市順華儀器有限公司；PHS-25數(shù)字式pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；LXJ-ⅡB飛鴿牌離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FD5-2.5凍干機(jī) 西盟生命技術(shù)有限公司；凱氏定氮裝置等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 仿栗籽→粉碎→過(guò)篩→脫脂→干燥→仿栗籽粕→堿液浸提→離心分離→上清液→酸沉→離心分離→透析→干燥→仿栗籽粗蛋白粉

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 原料預(yù)處理 仿栗籽經(jīng)干燥粉碎后用環(huán)己烷按1∶7的料液比置于水浴恒溫振蕩器中常溫振蕩脫脂4h，抽濾分離后置于通風(fēng)廚中12h以揮發(fā)殘余溶劑，得仿栗籽粕，過(guò)60目篩后于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 仿栗籽蛋白制備 取一定量仿栗籽粕與去離子水按一定料液比混合，用1mol/L NaOH調(diào)至一定pH，于一定溫度下水浴恒溫振蕩浸提一段時(shí)間，4500r/min離心20min，分離上清液，用1mol/L的HCl調(diào)至等電點(diǎn)（pH4.5），4000r/min離心15min后分離得到蛋白凝乳，用去離子水透析48h后，進(jìn)行真空干燥，即可得到仿栗籽粗蛋白粉。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 原料中粗蛋白含量測(cè)定采用半微量凱氏定氮法，參照GB5009.5-2003；上清液中蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[4]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

1.2.4 蛋白提取率的計(jì)算

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以蛋白提取率為指標(biāo)，分別對(duì)pH（8、8.5、9、9.5、10、10.5、11）、提取溫度（30、40、50、60、70℃）、提取時(shí)間（30、60、90、120、150、180min）、液料比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL））進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值，探討各因素變化對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響。

1.2.6 中心組合實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定中心組合實(shí)驗(yàn)因素與水平（見(jiàn)表1），以蛋白提取率為響應(yīng)值，通過(guò)SAS8.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析及嶺嵴分析，對(duì)仿栗籽蛋白提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[5-7]。

表1 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental variables and levels for the Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 pH對(duì)蛋白提取率的影響 取5g仿栗籽粕，設(shè)定提取溫度50℃、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間120min，不同浸提pH對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響如圖2所示。

由圖2可知，在堿性環(huán)境中仿栗籽蛋白質(zhì)提取率隨pH升高不斷增大，當(dāng)pH超過(guò)9.5后提取率變化不大。這是因?yàn)閴A液使仿栗籽蛋白發(fā)生酸式解離而帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)分子間互相排斥，分散性好，對(duì)蛋白質(zhì)分子有增溶作用，這種增溶作用隨著pH的升高而增大；但pH過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間發(fā)生縮合反應(yīng)，生成異味物質(zhì)和有害物質(zhì)[8-9]。因此，為保證提取的仿栗籽蛋白的品質(zhì)，pH控制在9.5左右為宜。

2.1.2 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響 取5g仿栗籽粕，設(shè)定浸提pH9.0、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間120min，不同提取溫度對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on protein yield

由圖3可知，仿栗籽蛋白質(zhì)提取率隨溫度升高先增加后減少，50℃時(shí)仿栗籽蛋白提取率最大。這是因?yàn)樵谳^低溫范圍內(nèi)隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生輕微改變，分子的立體結(jié)構(gòu)變得伸展，有利于蛋白質(zhì)分子和水分子的運(yùn)動(dòng)及其相互作用，從而使蛋白提取率增加；但當(dāng)溫度超過(guò)50℃后，維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級(jí)鍵被破壞，引起天然構(gòu)象的解體，原來(lái)在分子內(nèi)部的一些疏水基團(tuán)被暴露到分子表面，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的相互結(jié)合而凝結(jié)沉淀，蛋白提取率降低[10-11]。故提取溫度宜控制在50℃左右。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響 取5g仿栗籽粕，設(shè)定提取溫度50℃、浸提pH 9.0、料液比1∶20g/mL，不同提取時(shí)間對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on protein yield

從圖4可知，在一定條件下，蛋白質(zhì)的提取率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而增大，當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)120min后，蛋白質(zhì)的溶出基本達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[12]，提取率趨于平穩(wěn)，此時(shí)，延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)提取率的影響不大。因此，綜合各種因素，選擇提取時(shí)間為120min較佳。

2.1.4 料液比對(duì)蛋白提取率的影響 取5g仿栗籽粕，設(shè)定提取溫度50℃、浸提pH9.0、提取時(shí)間120min，不同料液比對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響如圖5所示。

圖5 料液比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratio on protein yield

從圖5可知，仿栗籽蛋白提取率隨著料液比的增大而增加，當(dāng)料液比超過(guò)1∶25后，隨料液比的增大，提取率趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)楫?dāng)料液比較低時(shí)，溶液的黏度較大，蛋白質(zhì)不能充分浸潤(rùn)，分子擴(kuò)散速率低，從而影響了傳質(zhì)過(guò)程；但料液比過(guò)大會(huì)增加水的消耗及后續(xù)的濃縮成本，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)意義不大[13-14]。因此，選擇料液比為1∶25較為適宜。

2.2 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面分析 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定pH（X1）、溫度（X2）、時(shí)間（X3）和料液比（X4）四個(gè)因素水平，以仿栗籽蛋白提取率（Y）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

通過(guò)SAS軟件的RSREG程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù)，即回歸方程為：

Y=63.5-0.914167X1-0.89X2-0.5425X3-0.643333X4-0.745833X12-1.279583X22-0.923333X32-3.232083X42-1.215X1X2+1.8825X1X3-0.175X1X4-3.91X2X3-0.585X2X4+0.935X3X4

為說(shuō)明回歸方程的有效性及各因素對(duì)提取率的影響程度，對(duì)該方程及各因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of results

從表3可知，回歸決定系數(shù)R2=0.9324，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有93.24%來(lái)源于所選因素的變化，模型修正決定系數(shù)R2Adj=0.8535，說(shuō)明該模型能解釋85.35%響應(yīng)值的變化，回歸方程的顯著性檢驗(yàn)極顯著，失擬性檢驗(yàn)不顯著，表明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況很好，可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。從方差分析表中各因素的F值可以看出，各因素對(duì)仿栗籽蛋白提取率影響大小順序?yàn)椋簻囟龋玖弦罕龋緋H＞時(shí)間，且溫度、料液比分別對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響達(dá)到了極顯著與顯著水平。

根據(jù)表3的分析結(jié)果，作出各顯著交互因素的響應(yīng)曲面圖（圖6、圖7）。由圖6、圖7及方差分析可得出，浸提pH、提取時(shí)間與提取溫度因素間的交互作用對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響最大，浸提pH與提取溫度的交互作用對(duì)仿栗籽蛋白提取率的效應(yīng)相關(guān)性呈山丘形曲面，它們之間的交互作用達(dá)到了顯著水平，提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)仿栗籽蛋白提取率的效應(yīng)相關(guān)性呈馬鞍形曲面，它們之間的交互作用達(dá)到了極顯著水平。由圖6可知，浸提pH一定時(shí)，蛋白提取率隨著溫度的升高呈先增加后下降的趨勢(shì)，且下降趨勢(shì)隨pH的增加越來(lái)越明顯，這說(shuō)明提取溫度升高有利于蛋白提取，但高溫容易使蛋白發(fā)生變性，造成提取率下降[15]；由圖7可知，當(dāng)提取溫度較低時(shí)，延長(zhǎng)提取時(shí)間，可獲得較高的蛋白提取率，但當(dāng)提取溫度較高時(shí)，延長(zhǎng)提取時(shí)間，蛋白提取率反而降低，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的高溫導(dǎo)致蛋白變性引起的[8]。

2.2.2 典型分析 典型分析結(jié)果可以判斷方程是否有極值存在，當(dāng)特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在；當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，為山丘曲面，有極大值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無(wú)極值存在[16]。為了確定最佳提取條件，通過(guò)SAS軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行典型分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖6 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface showing the interactive effects of pH and extraction temperature on protein yield

圖7 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface showing the interactive effects of length of extraction time and extraction temperature on protein yield

表4 典型分析表Table 4 Canonical analysis

從表4可以看出，4個(gè)因素的特征值有正有負(fù)，表明此二次響應(yīng)面是鞍面，無(wú)極值存在，這與以上響應(yīng)面圖的直觀顯示結(jié)果是一致的。因此不能直接從二次響應(yīng)面上找出最佳工藝參數(shù)，需要進(jìn)一步作嶺嵴分析。

2.2.3 嶺嵴分析 嶺嵴分析的原理是以原始設(shè)計(jì)中心點(diǎn)為球心，r為半徑的超球面與響應(yīng)面的交點(diǎn)形成的軌跡范圍內(nèi)找出最佳響應(yīng)值，即最佳工藝條件。嶺嵴分析的結(jié)果是對(duì)每個(gè)坐標(biāo)從編碼零值點(diǎn)開(kāi)始不斷擴(kuò)大，半徑r可以由實(shí)驗(yàn)者自行規(guī)定，但不能超出實(shí)驗(yàn)范圍[17]。為了便于分析，本文選取r在0、0.1、0.2、…1.0上計(jì)算嵴點(diǎn)。嶺嵴分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 嶺嵴分析Table 5 Ridge analysis

從表5可以看出，隨著編碼半徑r的增加，響應(yīng)值Y逐漸增大。由此可知，仿栗籽蛋白提取率隨pH、料液比、時(shí)間和溫度的增加而增大。在本實(shí)驗(yàn)的水平范圍內(nèi)，當(dāng)r=1.0時(shí)，此時(shí)的pH9.5973、提取溫度42.3385℃、提取時(shí)間138.3351min、料液比1∶25.2007（g/mL），仿栗籽蛋白的理論提取率為64.9024%，為方便實(shí)際操作，設(shè)定最優(yōu)提取條件為：pH9.6、提取溫度42℃、提取時(shí)間138min、料液比1∶25（g/mL），按此優(yōu)化工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到仿栗籽蛋白實(shí)際提取率為64.97%，與預(yù)測(cè)值基本一致且高于中心組合實(shí)驗(yàn)中的任何一組。因此，回歸擬合模型可較好地預(yù)測(cè)仿栗籽蛋白提取率，所得的仿栗籽蛋白提取工藝優(yōu)化條件是切實(shí)可行的。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法（RSA）研究了堿溶酸沉法提取仿栗籽蛋白的工藝條件，建立了仿栗籽蛋白提取率的二次回歸方程，其決定系數(shù)和修正系數(shù)分別為93.24%和85.35%；在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，所選因素對(duì)仿栗籽蛋白提取率影響大小順序?yàn)椋簻囟龋玖弦罕龋緋H＞時(shí)間，且溫度、料液比分別對(duì)仿栗籽蛋白提取率的影響達(dá)到了極顯著與顯著水平，仿栗籽蛋白提取率與提取溫度、pH、提取時(shí)間、料液比的二次回歸曲面為鞍面，無(wú)極值存在，需要通過(guò)嶺嵴分析找出最佳提取工藝條件。嶺嵴分析的結(jié)果表明，堿溶酸沉法提取仿栗籽蛋白的最佳工藝條件為：pH9.6、提取溫度42℃、提取時(shí)間138min、料液比1∶25（g/mL），在此條件下，仿栗籽蛋白提取率預(yù)測(cè)值為64.90%，與驗(yàn)證值64.97%基本一致，故回歸擬合模型能較好地預(yù)測(cè)仿栗籽蛋白提取率，所得的工藝優(yōu)化條件切實(shí)可行。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)仿栗籽蛋白的提取工藝進(jìn)行研究，研究結(jié)果可為仿栗籽資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Optimization of the extraction technology of protein from sloanea hemsleyana seed by response surface methodology

HUANG Wei1，2，MA Cheng-jin1，2，*，HUANG Qun2，SU Chao2，F(xiàn)ENG Lei2
（1.Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization，College of Hunan Province，Jishou University，Jishou 416000，China；2.Institute of Food Science，Jishou University，Jishou 416000，China）

TS255.6

B

1002-0306（2012）16-0246-05

2012－01－08 *通訊聯(lián)系人

黃偉（1986-），男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開(kāi)放基金項(xiàng)目（09K089）；吉首大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目（11JDYO43）。