蜂巢醋液態(tài)發(fā)酵工藝及其抗氧化活性研究

王振斌，孫 平，王 林，姜美花，夏 蓉

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

蜂巢醋液態(tài)發(fā)酵工藝及其抗氧化活性研究

王振斌1，孫 平1，王 林1，姜美花1，夏 蓉2

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

研究首次將蜂巢引入食醋的液態(tài)發(fā)酵工藝，優(yōu)化獲得了蜂巢醋液態(tài)發(fā)酵的最佳工藝條件：起始糖度5.33%，酵母活化液0.10%，酒精度5.0%，醋酸發(fā)酵溫度35℃。在此條件下制備的蜂巢醋由于發(fā)酵原料和菌種單一，在可溶性固形物、總糖、香氣、滋味等方面低于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品，而在色澤、體態(tài)和風(fēng)味典型性等方面較優(yōu)。此外，該蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和總抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均顯著低于固態(tài)發(fā)酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）產(chǎn)品，這主要?dú)w因于和固態(tài)發(fā)酵峰巢醋總黃酮和總多酚（0.71%，2.33%）相比，液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋總黃酮和總多酚含量（0.38%，1.20%）較低。

蜂巢醋，發(fā)酵工藝，抗氧化

Abstract：Honeycomb was used as raw material in the liquid fermentation of vinegar for the first time in this paper.The fermentation process was optimized and the optimum conditions was obtained：5.33%of initial sugar degree，0.10%of yeast activated liquid，5.0%of alcohol degree，35℃ of acetate fermentation temperature.Under the conditions，compared to solid-state fermentation the honeycomb vinegar was lower in soluble solids，total sugar，aroma，taste，but was higher in color，posture，flavor typicality.These results could be attributed to the single materials and strain in liquid fermentation of honeycomb vinegar.Moreover，DPPH radical scavenging activity（33.29%） and total antioxidant capacity（2252.63mmol·g-1） of the honeycomb vinegar by liquid fermentation were significantly lower than that of solid-state fermentation（66.25%，5092.63mmol·g-1），due to the lower content of flavonoids and polyphenol（0.38%，1.20%） compared to solid-state fermentation（0.71%，2.33%）.

Key words：honeycomb vinegar；fermentation technology；antioxidant activity

蜂巢（Honeycomb）是由蜜蜂的分泌物和采集物筑成的巢房，是蜂群生活、繁衍后代和貯存食物的場(chǎng)所，含有蜂蜜、蜂蠟、蜂花粉、蜂王漿、蜂膠、蜂毒、繭衣、幼蟲(chóng)分泌物等多種物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明蜂巢具有抑菌、抗病毒、降血脂、抑制腫瘤、提高免疫等多種功效[3-7]。然而，目前蜂巢主要用于制備蜂蠟、蜂巢復(fù)合飲料和蜂巢素，研究利用較為落后。食醋是我國(guó)傳統(tǒng)的酸性調(diào)味品，不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，而且具有獨(dú)特的藥理作用，其生產(chǎn)主要基于固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵。傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)周期長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大；液態(tài)發(fā)酵周期短，產(chǎn)能大，勞動(dòng)強(qiáng)度低，原料利用率高，是現(xiàn)代食醋生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)[8-12]。本研究擬將蜂巢的營(yíng)養(yǎng)功能成分引入食醋發(fā)酵過(guò)程中，優(yōu)化液態(tài)深層發(fā)酵關(guān)鍵工藝參數(shù)，獲得蜂巢醋生產(chǎn)的最佳生產(chǎn)條件，為蜂巢醋的研究開(kāi)發(fā)和現(xiàn)代化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蜂巢 由陜西咸陽(yáng)選民養(yǎng)蜂場(chǎng)提供；酵母 安琪酵母有限公司；蔗糖 市售，純度98%；醋酸菌 江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司；VC、DPPH（二苯代苦味酞肪自由基）、TPTZ（三吡啶三吖嗪） Sigma公司。

HH.B11-600-S型恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；DELTA320型pH計(jì) 上海梅特勒—托利多儀器有限公司；DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；WYT型手持糖度儀 成都光學(xué)廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂巢醋發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.2.1.1 固態(tài)發(fā)酵 在鎮(zhèn)江香醋傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上，以蜂巢提取液替代糯米浸漬用水，流程如下：蜂巢原料→解凍粉碎→20目過(guò)篩→超聲波水浴提取（超聲功率900W、超聲時(shí)間15min、液料比（L/S）=100∶1）→離心→蜂巢水提液+糯米（L/S=2∶1）→浸漬、蒸煮、淋飯冷卻→拌曲糖化、酒精發(fā)酵→加入醋酸菌發(fā)酵→淋醋殺菌→灌裝保存[13-14]

1.2.1.2 液態(tài)發(fā)酵 液態(tài)深層發(fā)酵工藝流程如下：蜂巢水提液（1.2.1.1）+蔗糖→滅菌（60℃，30min）→加入酵母，酒精發(fā)酵→調(diào)酒精度、pH→加入醋酸菌發(fā)酵→淋醋殺菌→灌裝保存[15-16]

1.2.2 蜂巢醋抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取0.5mL樣品于試管中，加入1.0mL 0.1mmol·L-1DPPH溶液振蕩搖勻，空白對(duì)照為95%乙醇，常溫避光反應(yīng)60min后于517nm測(cè)定吸光度，采用以下公式計(jì)算抑制率：

式中：Y：DPPH自由基抑制率（%），A0：空白對(duì)照吸光度，A：樣品吸光度[17-18]。

1.2.2.2 總抗氧化能力的測(cè)定 采用FRAP法測(cè)定總抗氧化能力，取100μL樣品于試管中，加入1.0mL FRAP工作液（0.3mol·L-1，pH3.6乙酸鈉緩沖液、10mmol·L-1TPTZ溶液和20mol·L-1三氯化鐵，以體積比10∶1∶1混和）混合均勻，37℃反應(yīng)50min，于593nm測(cè)定吸光度[19-20]。

1.2.3 蜂巢醋感官評(píng)價(jià) 蜂巢醋感官評(píng)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.2.4 成分分析 總酸、還原糖、酒精度、可溶性固形物分別根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T10345、GB/T15038、GB/T15038、GB2719測(cè)定；總黃酮和總多酚含量分別以蘆丁、沒(méi)食子酸為標(biāo)樣，采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定[21-22]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立樣品測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；統(tǒng)計(jì)分析采用F檢驗(yàn)，多重比較采用LSD法；p＜0.05被認(rèn)定為存在顯著性差異。

表1 蜂巢醋感官評(píng)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Full score standards of sensory evaluation of honeycomb vinegar

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂巢醋液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 起始糖度對(duì)蜂巢醋酒精發(fā)酵的影響 起始糖度對(duì)蜂巢醋的后續(xù)發(fā)酵具有重要的影響，一方面因?yàn)榇姿岚l(fā)酵需要較高的酒精度基礎(chǔ)上才能穩(wěn)定進(jìn)行，因而必須有較高的起始糖度；另一方面，起始糖度也不可太高，否則會(huì)使得發(fā)酵醪中酒精度太高，會(huì)抑制醋酸發(fā)酵，同時(shí)由于揮發(fā)的原因而引起損失增加。蜂巢水提液的起始糖度為2.33%。在添加0.1%酵母液，發(fā)酵溫度20℃的條件下，起始糖度對(duì)蜂巢醋酒精發(fā)酵的影響如圖1所示。從圖1可知，蜂巢水提液直接酒精發(fā)酵，發(fā)酵醪酒精度最高僅為2.5%，低于進(jìn)入醋酸發(fā)酵的最小酒精度（3.5%），不利于后期的醋酸發(fā)酵。當(dāng)起始糖度高于5.33%時(shí)，由于酵母對(duì)酒精的耐受性和氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)限制，發(fā)酵醪的最終酒精度無(wú)顯著差異。本實(shí)驗(yàn)選取以5.33%為制備蜂巢醋酒精發(fā)酵的初始糖度。

圖1 起始糖度對(duì)蜂巢醋酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of initial sugar degree on alcohol fermentation of honeycomb vinegar

2.1.2 酵母添加量對(duì)液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋酒精發(fā)酵的影響 在起始糖度為5.33%糖度，發(fā)酵溫度為20℃的條件下，酵母添加量對(duì)液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋酒精發(fā)酵的影響如圖2所示?？梢钥闯觯湍柑砑恿繛?.06%時(shí)，起酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3d，且最終的發(fā)酵醪酒精度較低（4.3%），這可能由于酵母添加量過(guò)低，酵母在發(fā)酵醪中先有氧繁殖后再無(wú)氧發(fā)酵，酵母繁殖消耗了發(fā)酵醪中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得酒精生成量降低。當(dāng)酵母添加量高于0.10%時(shí)，起酵時(shí)間短，接種第1d酒精生成量就達(dá)到1.0%左右，第3d酒精發(fā)酵即結(jié)束，但最終酒精度卻低于0.10%的酵母添加量。因此0.10%為最適宜的酵母添加量。

圖2 酵母添加量對(duì)蜂巢醋酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of yeast activated liquid volume on alcohol fermentation of honeycomb vinegar

2.1.3 初始酒精度對(duì)蜂巢醋醋酸發(fā)酵的影響 在醋酸發(fā)酵溫度為20℃的條件下，初始酒精度對(duì)液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋醋酸發(fā)酵的影響如圖3所示。初始酒精度對(duì)醋酸發(fā)酵有顯著的影響，當(dāng)初始酒精度低于5.0%時(shí)，起酵速度快，發(fā)酵時(shí)間短，但最終醋酸生成量較低；當(dāng)起始酒精度高于5.0%時(shí)，起酵速度慢，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，最終醋酸生成量與5.0%酒精度無(wú)顯著差異。因此選取5.0%為醋酸發(fā)酵的起始酒精度。

圖3 酒精度對(duì)蜂巢醋醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of alcohol degree on acetate fermentation of honeycomb vinegar

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)蜂巢醋醋酸發(fā)酵的影響 在起始酒精度5.0%的條件下，醋酸發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響如圖4所示。當(dāng)發(fā)酵溫度為45℃時(shí)，醋酸起酵速度最快，但最終醋酸濃度最低，其原因可能是在較高溫度下，醋酸發(fā)酵速度快，醋酸揮發(fā)速度也快，同時(shí)糖與蛋白質(zhì)發(fā)生褐變反應(yīng)的速度增加，部分糖不再轉(zhuǎn)化為酒精和醋酸，最終的發(fā)酵醪顏色較深，醋酸濃度較低[23]；當(dāng)發(fā)酵溫度為25、30℃時(shí)，發(fā)酵速度較慢，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10d，最終醋酸度較高，但是發(fā)酵醪顏色較淺，香氣較淡。因此，選取35℃為醋酸發(fā)酵的適宜溫度。

綜上所述，液態(tài)發(fā)酵制備蜂巢醋的最佳工藝條件為：起始糖度5.33%，酵母活化液0.1%，酒精度5.0%，醋酸發(fā)酵溫度35℃。

圖4 溫度對(duì)蜂巢醋醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of temperature on acetate fermentation of honeycomb vinegar

2.2 蜂巢醋成分分析與感官評(píng)價(jià)

在此條件下發(fā)酵蜂巢醋理化成分和感官評(píng)定結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋在可溶性固形物、總糖、香氣、滋味等方面低于固態(tài)發(fā)酵，而在色澤、體態(tài)和典型性方面明鮮優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵，其原因在于固態(tài)發(fā)酵采用糯米為原料，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，因而產(chǎn)品固形物和總糖含量高；固態(tài)發(fā)酵法時(shí)間長(zhǎng)，菌群豐富多變，產(chǎn)品香氣和滋味亦較好；液態(tài)發(fā)酵以蜂巢水提液和蔗糖為主要原料，成分簡(jiǎn)單，因而其風(fēng)味典型性強(qiáng)。

2.3 蜂巢醋抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.3.1 DPPH自由基清除率與總抗氧化能力 DPPH是一種穩(wěn)定存在的自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517nm處有最大吸收，當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑（如多酚）加入到其中時(shí)，和DPPH的單電子產(chǎn)生配對(duì)，使其在517nm處的吸收消失，吸光值越小說(shuō)明抗氧化劑清除DPPH自由基能力越強(qiáng)[17-18]。本研究以VC為陽(yáng)性對(duì)照，采用DPPH自由基清除能力分別評(píng)價(jià)了鎮(zhèn)江香醋、蜂巢水提液、液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋、固態(tài)發(fā)酵蜂巢醋的抗氧化活性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 蜂巢醋DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging activity of honeycomb vinegar

FRAP法是評(píng)價(jià)總抗氧化能力的常用方法，其原理是在酸性條件下抗氧化物可以還原Ferrictripyridyltriazine（Fe3+-TPTZ）產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，在593nm測(cè)定Fe2+-TPTZ的吸光值即可獲得樣品的總抗氧化能力，并且可以抑制內(nèi)源性的一些干擾因素[19-20]，結(jié)果如圖6所示。

表2 蜂巢醋成分分析與感官評(píng)價(jià)Table 2 Component analysis and sensory evaluation of honeycomb vinegar

圖6 蜂巢醋總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of honeycomb vinegar

從圖5和圖6可以看出，該液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和總抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均顯著低于固態(tài)發(fā)酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）產(chǎn)品。各樣品抗氧化能力由高到低依次為：固態(tài)發(fā)酵蜂巢醋＞VC＞鎮(zhèn)江香醋＞蜂巢水提液＞液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋。

2.4 蜂巢醋抗氧化成分分析

目前黃酮和多酚被認(rèn)為是天然產(chǎn)物中主要抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步了解蜂巢醋的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)，測(cè)定了其中的總黃酮和總多酚含量，結(jié)果如表2所示。液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋黃酮和多酚含量（0.38%，1.20%）與鎮(zhèn)江香醋無(wú)顯著差異，表明蜂巢水提液和糯米對(duì)最終產(chǎn)品主要抗氧化物質(zhì)的影響相同。另一方面，液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋黃酮和多酚含量顯著低于蜂巢水提液（0.54%，1.35%），固態(tài)發(fā)酵蜂巢醋黃酮和多酚含量（0.71%，2.33%）也明顯低于鎮(zhèn)江香醋和蜂巢水提液含量總和（0.99%，2.48%），這均說(shuō)明在蜂巢醋發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵醪中的黃酮和多酚被微生物部分消耗或轉(zhuǎn)化。再者，液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋黃酮和多酚含量?jī)H為固態(tài)發(fā)酵蜂巢醋的一半左右，而前者抗氧化活性也僅約為后者的一半，說(shuō)明蜂巢醋的抗氧化活性與其黃酮和多酚含量具有明顯的相關(guān)性，黃酮和多酚是蜂巢醋的主要抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)。

表3 蜂巢醋中總黃酮和總多酚含量Table 3 Content of total flavonoids and total polyphenol in honeycomb vinegar

3 結(jié)論

3.1 優(yōu)化獲得了蜂巢醋液態(tài)發(fā)酵的最佳工藝條件：起始糖度5.33%，酵母活化液0.10%，酒精度5.0%，醋酸發(fā)酵溫度35℃。在此條件下制備的蜂巢醋由于發(fā)酵原料和菌種單一，在可溶性固形物、總糖、香氣、滋味等方面低于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品，而在色澤、體態(tài)和風(fēng)味典型性等方面較優(yōu)。

3.2 蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和總抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均顯著低于固態(tài)發(fā)酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）產(chǎn)品，這主要?dú)w因于和固態(tài)發(fā)酵峰巢酸總黃酮和總多酚含量（0.71%，2.33%）相比，液態(tài)發(fā)酵蜂巢醋總黃酮和總多酚含量（0.38%，1.20%）較低。

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Liquid fermentation technology and antioxidant activity of honeycomb vinegar

WANG Zhen-bin1，SUN Ping1，WANG Lin1，JIANG Mei-hua1，XIA Rong2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Jiangsu Hengshun Vinegar Industry Co.，Ltd.，Zhenjiang 212013，China）

TS201.2

B

1002-0306（2012）16-0236-04

2012－01－04

王振斌（1975-），男，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。

國(guó)家星火計(jì)劃（2011GA690057）；鎮(zhèn)江市科技支撐項(xiàng)目（NY201010）。