響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻培養(yǎng)基

葛珍珍，王 杰，周燦燦，余曉斌

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻培養(yǎng)基

葛珍珍，王 杰，周燦燦，余曉斌*

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

為了提高小球藻的生物量，對BG11培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化。通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出了適合小球藻生長的最佳碳源、氮源分別為葡萄糖和尿素，并發(fā)現(xiàn)適量添加海綠素可顯著促進(jìn)小球藻的生長。利用Minitab軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了影響小球藻生長的三個(gè)最重要因子；通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析確定了三個(gè)因子的最佳濃度：磷酸氫二鉀58mg/L，硫酸鎂162mg/L，海綠素198μL/L。用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，48h后的藻細(xì)胞干重達(dá)10.09g/L，比優(yōu)化前提高了61.2%，油脂及蛋白質(zhì)產(chǎn)量分別達(dá)3.62和3.81g/L。

小球藻，響應(yīng)面，培養(yǎng)基優(yōu)化，海綠素

Abstract：In order to improve the biomass yield of Chlorella vulgaris，optimization of BG11 medium was carried out by response surface analysis.The optimal carbon and nitrogen sources for C.vulgaris were glucose and urea，respectively.An appropriate amount of seaweed liquid fertilizer could significantly promote the growth of C.vulgaris.Three most important substrates for C.vulgaris were screened via Plackett-Burman experiments using Minitab software.Optimal concentrations of the three substrates were confirmed by Box-Behnken design and response surface analysis.The results were 58mg/L of dipotassium hydrogen phosphate，162mg/L of magnesium sulfate and 198μL/L of seaweed liquid fertilizer.Cultivated with the optimized medium，dry cell weight of C.vulgaris after 48h reached 10.09g/L，increased by 61.2%compared with the original medium.The lipids yield was 3.62g/L，and the protein yield was 3.81g/L.

Key words：Chlorella vulgaris；response surface analysis；culture medium optimization；seaweed liquid fertilizer

小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)元素、多不飽和脂肪酸等重要的營養(yǎng)物質(zhì)，被FAO列為21世紀(jì)綠色健康食品[1]。1890年荷蘭微生物學(xué)家首次獲取了小球藻的純培養(yǎng)物；1950年，小球藻作為優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)品在日本率先被引入市場[2]。小球藻細(xì)胞內(nèi)含有多種活性成分如多糖、色素、小球藻生長因子（CGF）等[3]，由小球藻加工制成的多種食品[4]、飼料[5-6]、保健品等[7-8]已經(jīng)得以研發(fā)生產(chǎn)，對小球藻的研究也逐漸成為國內(nèi)外研究的前沿和焦點(diǎn)。小球藻可以進(jìn)行自養(yǎng)生長，也可以利用一些有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長[9]。與自養(yǎng)相比，異養(yǎng)培養(yǎng)能大幅度提高小球藻的生長速率，為工業(yè)化生產(chǎn)提供可能[10]。培養(yǎng)基的成分是影響小球藻生長速率的主要因素，對培養(yǎng)基的優(yōu)化是提高小球藻產(chǎn)量的有效途徑。響應(yīng)面分析法通過合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平及響應(yīng)值[11]。海綠素（seaweed liquid fertilizer）是一種天然海藻提取物，由英國歐麥思農(nóng)用流體公司研發(fā)，因含有生長素、細(xì)胞分裂素等多種天然植物激素及維生素、低聚糖等活性因子，海綠素已在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[12]，但其對藻類影響的研究尚未見報(bào)道，本文考察了碳源、氮源及海綠素對小球藻生長的影響，并對培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通小球藻（Chlorella vulgaris） 本實(shí)驗(yàn)室保藏藻種，編號CV03；基礎(chǔ)培養(yǎng)基 BG11[13]；海綠素 北京新禾豐農(nóng)化有限公司；葡萄糖等 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

GXZ光照培養(yǎng)箱 寧波艾德電子有限公司；HYLB全溫?fù)u瓶柜 太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2800AH紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；VELP UDK152全自動凱氏定氮儀 北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司。

1.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 碳源、氮源實(shí)驗(yàn) 碳源：以BG11為基礎(chǔ)，分別添加相同碳質(zhì)量濃度（4.8g/L）的葡萄糖、果糖、蔗糖和醋酸鈉培養(yǎng)小球藻，對照組不添加有機(jī)碳源進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000lux，光暗周期比為14L/10D，接種后48h取樣測細(xì)胞干重。

氮源：分別用相同氮質(zhì)量濃度（0.25g/L）的硝酸鈉、氯化銨、尿素和甘氨酸作為氮源，對照組不添加氮源，接種后48h取樣測細(xì)胞干重。

1.2.1.2 海綠素實(shí)驗(yàn) 向BG11培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的海綠素，接種后48h取樣測藻細(xì)胞干重，觀察海綠素對小球藻生長的影響。

1.2.2 Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn) Plackett-Burman設(shè)計(jì)法，是兩水平部分因子實(shí)驗(yàn)，適合從眾多因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，以便進(jìn)一步詳細(xì)研究[14]。根據(jù)前面的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)PB實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12，響應(yīng)值為培養(yǎng)48h后小球藻的細(xì)胞干重。

1.2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域里擬合方程與被近似的函數(shù)方程毫無相似之處，幾乎無意義[15]。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以因子水平變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因子的效應(yīng)來確定步長，能快速、準(zhǔn)確地逼近最佳值區(qū)域[16]。對PB實(shí)驗(yàn)所篩選出的重要因子進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)來確定各因素的水平。

1.2.4 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，其中常用的是Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理[17]。根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)并對其結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 細(xì)胞干重的測定 通過擬合藻細(xì)胞干重與藻液吸光值之間的線性關(guān)系來測定[18]：取對數(shù)期藻液，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描300～800nm，結(jié)果顯示小球藻在680nm處有最大吸收峰值。取一定量藻液，經(jīng)不同比例稀釋，測定各稀釋度對應(yīng)的細(xì)胞干重和吸光值，得到線性回歸方程：

細(xì)胞干重（g/L）=0.422×OD680-0.0026，R2=0.9971

1.2.5.2 油脂含量的測定 乙醚-石油醚法[19]。

1.2.5.3 蛋白質(zhì)含量的測定 凱氏定氮法[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源、氮源對小球藻生長的影響

碳源、氮源實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同碳源、氮源對小球藻生長的影響Table 1 Effect of different carbon and nitrogen sources on the growth of C.vulgaris

結(jié)果表明，葡萄糖為小球藻的最佳碳源，48h后的細(xì)胞干重比對照組提高了5倍，其次是蔗糖，而以醋酸鈉和果糖為碳源組，細(xì)胞干重僅比對照組略微增加。

沒有添加氮源的對照組小球藻生長最為緩慢，以尿素作為氮源培養(yǎng)小球藻生長最快，其次是硝酸鈉和甘氨酸，而以氯化銨作為氮源，觀察到藻液變黃，小球藻長勢較差。

2.2 海綠素對小球藻生長的影響

國內(nèi)外在海綠素對植物生長的影響方面做了大量研究，例如Thirumaran等[21]研究發(fā)現(xiàn)，20%的海綠素會促進(jìn)秋葵（Abelmoschus esculentus）的生長；陳衛(wèi)民等[22]指出，適量噴施海綠素可以改善全球紅葡萄的果實(shí)品質(zhì)；據(jù)報(bào)道海綠素對棉花、玉米的生長發(fā)育也有促進(jìn)作用[23-24]。藻類與植物在一些生理特性上存在相似性，因此考慮海綠素可能也會對藻類的生長繁殖起到促進(jìn)作用。海綠素對小球藻生長的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 海綠素對小球藻生長的影響Fig.1 Effect of seaweed liquid fertilizer on the growth of C.vulgaris

由圖1可知，當(dāng)海綠素濃度低于500μL/L時(shí)，能夠促進(jìn)小球藻的生長；在100μL/L時(shí)效果最佳，藻細(xì)胞干重（6.200g/L）相比對照組（4.380g/L）提高了41.55%；當(dāng)海綠素的添加量分別為1000和2000μL/L時(shí)，藻細(xì)胞干重分別為3.754和2.943g/L，均比對照組低。這表明，適量的海綠素會促進(jìn)小球藻的生長，而當(dāng)海綠素添加量大于1000μL/L時(shí)，對小球藻的生長無促進(jìn)作用，相反會抑制小球藻的生長。其原因可能是低濃度的海綠素為小球藻的生長提供了豐富的生長因子，海綠素中的細(xì)胞分裂素成分能夠促進(jìn)小球藻細(xì)胞的分裂增殖，從而使小球藻的細(xì)胞密度增大；但隨著海綠素濃度的增大，培養(yǎng)基中高濃度的細(xì)胞分裂素會對藻細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，從而抑制了藻細(xì)胞的生長。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了海綠素對藻類生長的促進(jìn)效應(yīng)，可為海綠素在藻類培養(yǎng)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

2.3 Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

PB實(shí)驗(yàn)選取葡萄糖等影響小球藻生物量的7個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素分高、低兩個(gè)水平，其中高水平為低水平的1.5倍，PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

由表2可以看出，影響小球藻細(xì)胞干重的重要因子（置信度＞90%）包括海綠素、硫酸鎂和磷酸氫二鉀，且均為正效應(yīng)（T值＞0），其中海綠素的主效應(yīng)極顯著（p=0.004），而其他因素的影響不顯著。利用Minitab軟件繪出各因子標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖（圖2），響應(yīng)值為培養(yǎng)48h后小球藻的細(xì)胞干重，α=0.05，Minitab在Pareto圖中顯示效應(yīng)的絕對值，由Pareto圖可以更為直觀地發(fā)現(xiàn)海綠素、硫酸鎂、磷酸氫二鉀具有顯著性（t＞參考值2.132）。因此將海綠素、硫酸鎂、磷酸氫二鉀3個(gè)培養(yǎng)基組分作為主要因子進(jìn)行下一步的分析研究。

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

圖2 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖Fig.2 Pareto chart of standardized effect

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對小球藻細(xì)胞干重有顯著影響的海綠素、硫酸鎂、磷酸氫二鉀皆為正效應(yīng)，因此其濃度水平應(yīng)增加，根據(jù)三個(gè)因素的效應(yīng)值大小設(shè)計(jì)它們的變化方向及步長進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of steepest ascent test

從表3可以看出，最佳水平條件出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組2與實(shí)驗(yàn)組3之間，確定以實(shí)驗(yàn)組3的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)PB及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的三個(gè)因素及其水平，具體見表4。

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。以小球藻的細(xì)胞干重為響應(yīng)值，利用Minitab軟件對Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析及回歸擬合[25]（表6），得到響應(yīng)值Y與因子X之間的回歸方程：Y=10.0283+0.0237X1+0.1635X2-0.1029X3-0.4315X12-0.2469X22-0.3576X32-0.1424X1X2+0.1583X1X3+0.1319X2X3

由表6中的回歸分析結(jié)果可知，模擬方程中的常量項(xiàng)p值為0，表明此模型顯著。其中X2、X12、X22、X32和X1X3對小球藻的細(xì)胞干重都有顯著的影響（p＜0.05），決定系數(shù)R2為0.9595，表明此回歸方程擬合得很好[26]?；貧w方程的方差分析結(jié)果見表7，可知回歸、線性、平方及交互作用的效應(yīng)都較顯著（p值分別為0.006、0.033、0.002和0.047），失擬檢測p值為0.300（＞0.05），表明失擬不顯著，回歸模型適合[27]。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)Table 4 Factors and levels of Box-Behnken design

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 回歸方程的系數(shù)估計(jì)值Table 6 Estimation value of regression coefficient in regression equation

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.6 響應(yīng)面最優(yōu)值的獲取及驗(yàn)證

利用Minitab軟件繪制出上述回歸方程的響應(yīng)面立體圖，見圖3～圖5。

圖3 Y=f（X1、X2）響應(yīng)面立體分析圖Fig.3Response surface plot of the function Y=f（X1、X2）

圖4 Y=f（X1、X3）響應(yīng)面立體分析圖Fig.4Response surface plot of the function Y=f（X1、X3）

圖5 Y=f（X2、X3）響應(yīng)面立體分析圖Fig.5Response surface plot of the function Y=f（X2、X3）

對回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零得三元一次方程組，利用Matlab軟件求解[28]，得極值點(diǎn)坐標(biāo)X1=-0.0424，X2=0.3181，X3=-0.0946，相應(yīng)因子及對應(yīng)值分別為：海綠素198μL/L、硫酸鎂162mg/L、磷酸氫二鉀58mg/L，并預(yù)測響應(yīng)值（48h后小球藻的細(xì)胞干重）為10.06g/L。以優(yōu)化前的培養(yǎng)基為對照，用此模型條件培養(yǎng)小球藻，48h后的藻細(xì)胞干重為10.09g/L（與預(yù)測值差0.3%），比對照組（6.26g/L）提高了61.2%；油脂含量為3.62g/L，占細(xì)胞干重的35.88%；蛋白質(zhì)含量為3.81g/L，占細(xì)胞干重的37.76%。

3 結(jié)論

本文通過單因子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小球藻的最佳碳、氮源為葡萄糖和尿素；適當(dāng)濃度的海綠素對小球藻的生長具有顯著促進(jìn)作用，當(dāng)海綠素的濃度為100μL/L時(shí)，效果最佳，藻細(xì)胞干重相比對照提高了41.55%；而當(dāng)濃度大于1000μL/L時(shí)，對小球藻的生長則產(chǎn)生抑制作用。

利用Minitab軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對BG11培養(yǎng)基進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化分析，優(yōu)化后的BG11培養(yǎng)基配方為：K2HPO458mg/L，MgSO4·7H2O 162mg/L，海綠素198μL/L；其他成分的濃度為：葡萄糖12g/L，尿素0.53g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，檸檬酸0.006g/L，檸檬酸鐵銨0.006g/L，EDTANa20.001g/L，A5微量元素液1mL/L；利用此優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，48h后的藻細(xì)胞干重達(dá)10.09g/L，比優(yōu)化前提高了61.2%。

[1]張強(qiáng).小球藻活性成分的研究及食品方面的開發(fā)進(jìn)展[J].山東青年，2010（8）：59-60.

[2]Dhyana B，Beverly A.Chlorella：the emerald food[M].Berkeley：CA，1984：2-5.

[3]郝宗娣，劉洋洋，續(xù)曉光，等.小球藻（Chlorella）活性成分的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2010，31（12）：369-372.

[4]何擴(kuò)，張秀媛，李玉鋒.小球藻破壁技術(shù)及其藻片研制[J].食品工業(yè)科技，2006，27（2）：147-151.

[5]周蔚，樊磊，韋金河，等.小球藻在豬飼料中應(yīng)用的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（4）：95-96.

[6]王冉，孫展兵，商慶凱.小球藻粉作為飼料添加劑的營養(yǎng)價(jià)值及安全性研究[J].飼料博覽，2005（4）：4-7.

[7]劉進(jìn)杰，劉倩，張玉香，等.小球藻保健酸乳工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（5）：285-289.

[8]付桂明，萬茵，呂穎峰，等.藍(lán)綠藻營養(yǎng)口服液的研制[J].食品工業(yè)科技，2008，29（4）：165-168.

[9]江懷真，張維，劉天中，等.氮、磷濃度對小球藻生長及油脂積累的影響[J].食品工業(yè)科技，2011，32（6）：204-207.

[10]景建克，許倩倩，劉碩，等.大規(guī)模異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)小球藻USTB-01研究[J].現(xiàn)代化工，2008，28（12）：67-70.

[11]雷德柱，胡位榮.生物工程中游技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2010，43-45.

[12]Bai NR，Christi RM，Kala TC.Seaweed liquid fertilizer as an alternate source of chemical fertilizer in improving the yield of Vigana Radiata L.[J].Plant Archives，2011，11（2）：895-898.

[13]Stanier RY，Kunisawa R，Mandel M，et al.Purification and properties of unicellular blue-green algae（Order Chroococcales）[J].Bacteriological Reviews，1971，35（2）：171-205.

[14]郝學(xué)財(cái)，余曉斌，劉志鈺，等.響應(yīng)面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（1）：38-41.

[15]Davies OL，George EP，Lewis RC.The design and analysis of industrial experiments[M].London：Longman Group Limited，1978：45-48.

[16]Montgomery DC.Design andanalysis of experiments[M].New York：John Wiley&Sons，1991：35-40.

[17]Ferreira SLC，Bruns RE，F(xiàn)erreim HS，et al.Box-Behnken design：An alternative for the optimization of analytical methods[J].Analytica Chimica Acta，2007，597（2）：179-186.

[18]呂旭陽，張雯，楊陽，等.分光光度法測定小球藻數(shù)量的方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（23）：11104-11105.

[19]孫曉璐，孫玉梅，陳莉，等.不同酵母菌發(fā)酵產(chǎn)油脂及脂肪酶的研究[J].糧油加工，2007（8）：80-82.

[20]于曼，呂玉瓊.全自動凱氏定氮儀測定食品中蛋白質(zhì)[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2001，11（5）：610-611.

[21]Thirumaran G，Arumugam M，Arumugam R，et al.Effect of seaweed liquid fertilizer on growth and pigment concentration of Abelmoschus esculentus（L.） mediku[J].American-Eurasian Journal of Agronomy，2009，2（2）：57-66.

[22]陳衛(wèi)民，鐘寧，楊飛.海綠素對全球紅葡萄品質(zhì)影響[J].北方園藝，2010（17）：53-54.

[23]孫盈萍，羅巨海，宋國華，等.海綠素在棉花生產(chǎn)上的應(yīng)用探討[J].石河子科技，2008（5）：4-6.

[24]Matysiak K，Kaczmarek S，Krawczyk R.Influence of seaweed extracts and mixture of humic and fulvic acids on germination and growth of Zea mays L.[J].Acta Scientiarum Polonorum，Agriculture，2011，10（1）：33-45.

[25]洪楠，候軍，李志.MINITAB統(tǒng)計(jì)分析教程[M].北京：電子工業(yè)出版社，2007：233-237.

[26]Joglekar AM，May AT.Product excellence through design of experiments[J].Cereal Foods World，1987（32）：857-868.

[27]Angela D，Daniel V.Design and analysis of experiments[M].New York：Springer，1999：243-258.

[28]任玉杰.數(shù)值分析及其MATLAB實(shí)現(xiàn)[M].北京：高等教育出版社，2007：167-168.

Optimization of medium for Chlorella vulgaris by response surface analysis

GE Zhen-zhen，WANG Jie，ZHOU Can-can，YU Xiao-bin*
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0195-05

2012-01-04 *通訊聯(lián)系人

葛珍珍（1988-），女，碩士，研究方向：微生物學(xué)。