超高效液相色譜質(zhì)譜法快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的四種獸藥殘留

沙美蘭，曹 鵬，2，*，李金強(qiáng)，王倩倩，關(guān)麗麗，牟 妍

（1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái) 264000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

超高效液相色譜質(zhì)譜法快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的四種獸藥殘留

沙美蘭1，曹 鵬1，2，*，李金強(qiáng)1，王倩倩1，關(guān)麗麗1，牟 妍1

（1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái) 264000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

建立了采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀快速檢測(cè)動(dòng)物組織中甲氧芐胺嘧啶、克林霉素、泰妙菌素和吡喹酮四種藥物殘留的分析方法。動(dòng)物組織樣品經(jīng)乙腈提取后，用正己烷去除脂肪等雜質(zhì)，Waters Acquily UPLC BEH C18色譜柱分離，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正離子（ESI+）模式電離，液相色譜-質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）測(cè)定。結(jié)果表明：4種藥物在2.5～200μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.996，在此范圍內(nèi)添加回收率為65.8%～95.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～13.1%，定量下限為0.5μg/kg。

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，甲氧芐胺嘧啶，克林霉素，泰妙菌素，吡喹酮，動(dòng)物源性食品

Abstract：An ultra performance liquid chromatography coulped to tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）method was established for the determination of trimethoprim，clindymycin，tiamulin and praziquantel residues in animal origin food．The sample was extracted with acetonitrile，purified by hexane，and detected on Waters Acquity UPLC BEH C18column by a gradient elution using acetonitrile（A）—0.1%formic acid（B） as mobile phase with a flow rate of 0.3mL/min．The calibration curves were good linear between the peak areas and concentrations of 4 veterinaries in the range of 2.5～200μg/L，with correlation coefficients more than 0.996．The average recoveries at this concentration levels ranged from 65.8%to 95.9%，the RSD was in the range of 3.2%～13.1%.The limits of quantification of 4 drugs in animal origin food were 0.5μg/kg.

Key words：UPLC-MS/MS；trimethoprim；clindymycin；tiamulin；praziquantel；animal original foods

最近，隨著食品安全事件的頻繁出現(xiàn)，人們對(duì)食品安全也愈發(fā)的重視，雖然國(guó)家對(duì)相關(guān)藥物做了規(guī)范，但是在利益的驅(qū)使下，還是有不少濫用抗生素的現(xiàn)象。甲氧芐胺嘧啶、泰妙菌素、吡喹酮和克林霉素這四種藥物作為抗生素和抗菌素因其特有的效果，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽類和水產(chǎn)品的養(yǎng)殖中，主要用于防治呼吸系統(tǒng)疾病和寄生蟲疾病中等。但是，人們長(zhǎng)期食用含有這些藥物殘留的食物，會(huì)對(duì)身體健康帶來很大的安全隱患。2010年6月，韓國(guó)增加針對(duì)水產(chǎn)品的檢測(cè)項(xiàng)目，新增抗生素類中就包括甲氧芐胺嘧啶（trimethoprim）、克林霉素（clindymycin）、泰妙菌素（tiamulin）、吡喹酮（praziquantel），在魚類或甲殼類中的限量分別為0.05、0.1、0.1、0.02mg/kg。目前，除了泰妙菌素，其他3種藥物分別有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1-3]，但是每個(gè)項(xiàng)目均為獨(dú)立的前處理方法和儀器檢測(cè)方法，并且很多文獻(xiàn)報(bào)道也僅是局限于一種藥物在各種基質(zhì)中的檢測(cè)，主要是液相色譜法[4-9]和液相色譜—質(zhì)譜法[10-14]，不能同時(shí)、快速的進(jìn)行分析檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這4種常見藥物建立了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，對(duì)人們的身體健康和控制產(chǎn)品質(zhì)量具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氧芐胺嘧啶（CAS：738-70-5，99.5%）、泰妙菌素（CAS：55297-95-5，98.5%）、克林霉素（CAS：18323-44-9，99.0%）、吡喹酮（CAS：55268-74-1，99.0%） 均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer；乙腈、甲醇、正己烷 德國(guó)默克公司，色譜純；水 為超純水；硫酸鈉（分析純）、甲酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Waters Acquity UPLC-Quattro Premier XE，配有電噴霧離子源（ESI）及MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)美國(guó)Waters公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI；超純水儀 美國(guó)Millipore公司；DL-5C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FJ200-9均質(zhì)器 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 雞肉、豬肉、石鰈魚、雪蟹取可食用部分用食品攪拌機(jī)制成均勻樣品，冷凍保存，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液喹酮的配制 分別稱取0.0100g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光保存。

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于容量瓶中，用乙腈與水混合溶液（4∶6，V/V）稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液并定容至刻度線，4℃避光保存。

1.2.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱取5.0g（精確至0.01）均質(zhì)樣品、5g無水硫酸鈉，置于50mL離心管中，加入20mL乙腈，振蕩提取，5000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中，殘?jiān)屑尤?5mL乙腈，再次提取1次，合并上清液至分液漏斗中。向分液漏斗中加入20mL乙腈飽和的正己烷，振蕩搖勻，靜置分層，取下層乙腈至雞心瓶中。40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入1mL乙腈/水（4∶6，V/V）含0.1%的甲酸混合溶液，超聲使其完全溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至2.0mL小離心管中，向其中再加入1mL乙腈飽和正己烷，12000r/min高速離心10min。吸下層過0.22μm的濾膜。

1.2.5 色譜、質(zhì)譜條件

1.2.5.1 液相色譜條件色譜柱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～3min，10%A線性變化至90%A，3～4min，維持90%A，4～5min，維持10%A；流速：0.3mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量：2μL。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI+）；毛細(xì)管電壓為3.0kV；源溫120℃；脫溶劑溫度為350℃；脫溶劑氣流速為600L/h；錐孔反吹氣流速為50L/h。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)各離子對(duì)及各優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 4種藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of MRM mode for 4 drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 提取與凈化條件的優(yōu)化

4種藥物均為極性物質(zhì)，對(duì)提取液的選擇主要集中在乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈，經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)比較（圖1），發(fā)現(xiàn)用乙腈提取能滿足所有組分回收率在理想范圍內(nèi)，且雜質(zhì)干擾少，故本方法最終采用常用的試劑乙腈提取，同時(shí)達(dá)到沉淀蛋白的目的。

圖1 不同提取溶劑下回收率的比較Fig.1 The comparison of recovery with different extraction solvents

凈化方法的確定比較了固相萃取小柱和液液分配萃取兩種凈化方法。采用固相萃取柱對(duì)雞肉、豬肉等動(dòng)物組織有明顯的提取凈化效果，但對(duì)粘稠性膠體狀復(fù)雜性樣品如魚、蝦等則存在易堵塞、不宜洗脫、操作繁瑣、成本較高等問題。本文旨在快速檢測(cè)，故舍棄固相萃取凈化的步驟，而采用正己烷與乙腈液液分配去除脂肪等雜質(zhì)，定容后再用乙腈飽和正己烷去除油脂等大分子雜質(zhì)，能有效地消除基質(zhì)干擾，同時(shí)靈敏度也能滿足檢測(cè)需要，提高了工作效率，達(dá)到了快速檢測(cè)的目的。另外，在樣品提取過程中，加入無水硫酸鈉可以有效防止樣品中的水分及干擾成分進(jìn)入提取液，同時(shí)硫酸鈉的存在可促使蛋白質(zhì)變性分散，防止樣品形成塊狀影響提取效率。

2.2 定容液的優(yōu)化

除了試劑要保證充分提取外，定容液也是一個(gè)重要的控制點(diǎn)。4種藥物中，除了甲氧芐胺嘧啶的極性較大外，其他3種均為弱極性藥物，要同時(shí)分析這4種藥物，并均獲得良好的回收率，首先采用了甲醇+水體系，分別為2+8，4+6，6+4，但這4種藥物均洗脫不充分，回收率比較低；之后改用乙腈+水體系，分別為2+8，4+6，6+4。結(jié)果表明，乙腈比例低，回收率低；乙腈比例高，甲氧芐胺嘧啶的峰形變差。最終選用乙腈+水（4+6）效果最好，每個(gè)組分的峰形和回收率都能達(dá)到滿意的結(jié)果。另外，由于甲氧芐氨嘧啶是強(qiáng)極性物質(zhì)，含有電負(fù)性強(qiáng)的原子，在定容液中加入0.1%的甲酸（體積比），甲氧芐胺嘧啶的回收率有所提高，見圖2。

圖2 不同定容體系的回收率Fig.2 The recovery of different constant systems

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了Waters ACQUITY UPLC HSS T3Column（2.1mm×50mm，1.8μm）、Waters ACQUITY SHIELD RP18Column（2.1mm×50mm，1.7μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column（2.1mm×50mm，1.7μm）三種柱子，發(fā)現(xiàn)BEH C18對(duì)這4種藥物的保留性、靈敏度和峰形都表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。最終選擇以BEH C18色譜柱為分離柱。

采用乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，4種藥物均分離良好，峰形尖銳對(duì)稱，5min內(nèi)就能完成一個(gè)樣品的檢測(cè)，且目標(biāo)峰沒有基質(zhì)干擾。

乙腈和水是實(shí)驗(yàn)室常備試劑，省去了配制流動(dòng)相的步驟，同時(shí)對(duì)柱子的損耗也比用鹽做流動(dòng)相要小的多，同時(shí)也節(jié)省了沖洗柱子的時(shí)間，大大提高了工作效率。另外，已有研究表明，在流動(dòng)相中加入甲酸有利于準(zhǔn)分子離子的生成[15]，促進(jìn)化合物的電離，提高靈敏度。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)首先采用1mg/L各種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蠕動(dòng)泵進(jìn)樣方式在電噴霧正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，找出準(zhǔn)確的分子離子作為母離子，然后以分子離子為母離子對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，最后選取豐度較強(qiáng)的2個(gè)子離子，優(yōu)化其錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。選擇豐度較大并且響應(yīng)穩(wěn)定的來做定量離子。

2.5 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

準(zhǔn)確配制2.5、10、20、50、100、200μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣。以各藥物定量離子的質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看出4種藥物在2.5～200μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.996，見表2。

表2 4種獸藥的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges，regression equation and related coefficient for 4 drugs

采用空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法，根據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥10為方法定量下限，得出4種藥物在樣品（豬肉、雞肉、石鰈魚、雪蟹）中的定量下限均為0.5μg/kg?？瞻纂u肉中添加4種2.5μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖3。

圖3 雞肉樣品空白與添加標(biāo)準(zhǔn)品回收的質(zhì)量色譜圖Fig.3 MRM spectra of blank sample of chicken and blank chicken sample with addition of the 4 drugs

表3 添加回收率的結(jié)果（n=5）Table 3 Results of recovery（n=5）

2.6 回收率與重復(fù)性

分別對(duì)四種基質(zhì)（豬肉、雞肉、石鰈魚、雪蟹）的樣品進(jìn)行了3個(gè)水平（0.5、2、10μg/kg）的添加回收實(shí)驗(yàn)，每一添加水平重復(fù)5次。結(jié)果表明，4種藥物在空白樣品中的平均加標(biāo)回收率在65.8%～95.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～13.1%。符合殘留檢測(cè)方法對(duì)回收率與精密度的要求?；厥章屎拖鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

3 結(jié)論

通過對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化和改進(jìn)，建立了以雞肉、豬肉、石鰈魚和雪蟹為代表的動(dòng)物源性食品中4種常見藥物殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法。該法前處理簡(jiǎn)單易操作，分析時(shí)間短，5min就能完成一個(gè)樣品的檢測(cè)，并且線性范圍寬，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，定量限（LOQ）可達(dá)到0.5μg/kg，能滿足獸藥殘留高通量分析的要求。

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Rapid determination of four veterinary drugs residue in animal products by UPLC-MS/MS

SHA Mei-lan1，CAO Peng1，2，*，LI Jin-qiang1，WANG Qian-qian1，GUAN Li-li1，MU Yan1
（1.Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai 264000，China；2.College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

TS207.5+3

A

1002-0306（2012）16-0082-04

2011－12－26 *通訊聯(lián)系人

沙美蘭（1981-），女，助理工程師，研究方向：獸殘檢測(cè)。