高效液相色譜法測(cè)定頭孢呋辛酯中高分子聚合物

王 玲，胡朝新，陸紅彬，馮曉燕

蘇州致君萬慶藥業(yè)有限公司，江蘇太倉 215415

β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前臨床上最常用的抗感染藥物，但其常易引發(fā)過敏反應(yīng)，甚至過敏性休克，威脅患者的生命安全。多年的研究已證明，抗生素所致的速發(fā)型過敏反應(yīng)并非由藥物本身所致，而是與藥物中存在的高分子雜質(zhì)有關(guān)[1]。此外，一些抗菌藥物（如鏈霉素、某些頭孢菌素）中的高分子雜質(zhì)，還和藥物的毒性反應(yīng)有關(guān)，故對(duì)抗菌藥物中高分子雜質(zhì)進(jìn)行控制具有重要的意義[2]?！吨袊幍洹穼?duì)眾多抗生素制定了高分子聚合物檢測(cè)方法，例如:頭孢尼西鈉、頭孢呋辛鈉、頭孢替唑鈉、頭孢噻吩鈉等；其中《中國藥典》2005版二部[3]收載了11個(gè)品種21個(gè)聚合物檢查標(biāo)準(zhǔn)，2010版二部[4]在此基礎(chǔ)上收載了21個(gè)品種42個(gè)聚合物檢查標(biāo)準(zhǔn)。頭孢呋辛酯為脂溶性樣品，《中國藥典》2010版、USP 32版[5]、日本藥典JPⅩⅤ[6]及EP6.0[7]均收載了該品種，但均未對(duì)該藥中的高分子雜質(zhì)進(jìn)行控制。通過調(diào)研，采用聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物（分子量使用范圍＜10000）為填充劑的色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，成功對(duì)頭孢呋辛酯中的高分子聚合物進(jìn)行分離分析，為該藥的質(zhì)量控制提供了新的檢測(cè)方法，保證了藥品質(zhì)量。

1 材 料

1.1 儀器

島津LC-20A型高效液相色譜儀（含LC-20AT型高壓輸送泵、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、LC-solution色譜工作站）。

1.2 試藥

二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；無水溴化鋰（A Johnson Matthey Company）；頭孢呋辛酯對(duì)照品（批號(hào):130492-200402，中國藥品生物制品檢定所，純度:80.8%）；頭孢呋辛酯樣品（本公司自制，批號(hào):090901、090902、090903）；頭孢呋辛酯膠囊（英國葛蘭素史克公司，商品名:西力欣誖，批號(hào):C419105）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為TSK凝膠柱G2000 HHR（7.8 mm×300 mm）；流動(dòng)相:0.030 mol·L-1LiBr溶液（稱取 Li-Br 2.6 g，加二甲基甲酰胺溶解并稀釋至1000 mL）；流速:0.33 mL·min-1；檢測(cè)波長:280 nm；進(jìn)樣量:20 μL；柱溫:室溫。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取頭孢呋辛酯樣品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 mL中含頭孢呋辛酯（無水物計(jì)）0.2 mg的溶液。

2.2.2 對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置

100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.3.1 空白溶劑的選擇 分別采用二甲基甲酰胺（DMF）、流動(dòng)相為空白溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用DMF為空白溶劑時(shí)，在主峰出峰位置后（約25 min處）有一明顯倒峰，影響聚合物測(cè)定，而空白流動(dòng)相無任何雜質(zhì)峰出現(xiàn)，不影響測(cè)定結(jié)果，故確定采用流動(dòng)相為空白溶劑，用以配制供試品溶液。見圖1。

圖1 不同溶劑的HPLC色譜圖

2.3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。試驗(yàn)結(jié)果顯示，其峰面積RSD為1.4%（＜4.0%），符合要求。見圖2。

圖2 對(duì)照溶液的HPLC色譜圖

再精密量取對(duì)照溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，主峰面積應(yīng)為上述對(duì)照溶液主峰面積的20%～40%。結(jié)果靈敏度測(cè)定主峰面積為122606，為對(duì)照溶液主峰面積的29.9%，符合要求。試驗(yàn)表明，本色譜條件下，系統(tǒng)適用性良好。

2.4 聚合物重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取頭孢呋辛酯（批號(hào):090901）10 mg，共6份，分別置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以聚合物測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，6次測(cè)定聚合物峰面積分別為61743、65772、63630、65346、67622、68762，RSD 為 3.1%（＜5.0%），重復(fù)性良好。

2.5 供試品溶液濃度與聚合物測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性考察

精密稱取3份同批次供試品（批號(hào):090901）10、20、30 mg，分別置 3 個(gè) 100 mL 量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以濃度X（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，按最小二乘法進(jìn)行線性回歸。結(jié)果頭孢呋辛酯在0.104～0.304 mg·mL-1范圍內(nèi)，溶液濃度與聚合物峰面積呈良好的相關(guān)性，線性回歸方程為 Y=3.536×105X-3.182×103（r=0.9998）。

2.6 對(duì)照溶液的最低檢測(cè)限與定量限

取頭孢呋辛酯對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解并逐步稀釋至濃度為 0.0081 μg·mL-1時(shí)，精密量取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄的色譜圖中主峰峰高約為基線噪音的10倍，計(jì)算本品的定量限為0.162 ng；再逐步稀釋至濃度為0.0034 μg·mL-1時(shí)，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄的色譜圖中主峰峰高約為基線噪音的2～3倍，計(jì)算本品的檢測(cè)限為0.068 ng。見圖3。

圖3 頭孢呋辛酯最低檢測(cè)限色譜圖

2.7 破壞試驗(yàn)

由于本色譜系統(tǒng)為無水系統(tǒng)，無法進(jìn)行酸、堿、氧化破壞試驗(yàn)，為考察頭孢呋辛酯聚合物受外界條件變化情況，設(shè)計(jì)如下試驗(yàn):取頭孢呋辛酯樣品（批號(hào):090901）適量，置敞口量瓶中，分別在高溫60℃、強(qiáng)光4500lx、高濕75%條件下放置10天，考察聚合物變化情況，結(jié)果見表1。

表1 頭孢呋辛酯破壞試驗(yàn)聚合物測(cè)定結(jié)果（%）

試驗(yàn)結(jié)果表明，頭孢呋辛酯聚合物在高溫及高濕條件下略有增加，在光照條件下增加較快，說明本品對(duì)光照較為敏感，應(yīng)避光保存。同時(shí)，上述破壞條件下高分子聚合物與主峰均能有效分離，表明本色譜系統(tǒng)專屬性良好。

2.8 樣品聚合物測(cè)定

取3批供試品、進(jìn)口頭孢呋辛酯膠囊（西力欣誖）、頭孢呋辛酯對(duì)照品、國內(nèi)其他廠家生產(chǎn)的頭孢呋辛酯原料，分別以峰面積歸一化法、不加校正因子的自身對(duì)照法，計(jì)算供試品中聚合物的量，結(jié)果見表2、圖 4。

表2 頭孢呋辛酯聚合物測(cè)定結(jié)果（%）

圖4 頭孢呋辛酯聚合物檢查供試品色譜圖

3 討 論

3.1 色譜柱的選擇。由于頭孢呋辛酯為脂溶性樣品，不溶于水及相關(guān)助溶劑，無法采用常規(guī)的sephadex G-10型葡聚糖凝膠柱進(jìn)行試驗(yàn)，通過比較，試驗(yàn)采用日本TOSOH公司生產(chǎn)的TSK凝膠柱G2000 HHR進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，該色譜柱可以有效檢測(cè)出頭孢呋辛酯樣品中的高分子聚合物。

3.2 雜質(zhì)計(jì)算方法。樣品檢測(cè)結(jié)果表明，采用峰面積歸一化法、不加校正因子的自身對(duì)照法，兩種計(jì)

算方法分別測(cè)得的頭孢呋辛酯聚合物量結(jié)果一致。考慮到試驗(yàn)所用溶劑為二甲基甲酰胺（色譜純），價(jià)格較為昂貴，回收處理困難，易造成環(huán)境污染；供試品溶液濃度與聚合物測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性考察試驗(yàn)結(jié)果也表明，供試品溶液在0.104～0.304 mg·mL-1范圍內(nèi)，溶液濃度與聚合物峰面積呈良好的線性關(guān)系，故試驗(yàn)可以采用峰面積歸一化法來計(jì)算供試品中聚合物的量。

3.3 聚合物的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，聚合物的含量會(huì)隨時(shí)間的延長而增大，故檢測(cè)聚合物含量時(shí)應(yīng)在溶液配制后立即進(jìn)樣。

3.4 該方法適用于檢查頭孢呋辛酯原料及相應(yīng)制劑中的聚合物含量，如頭孢呋辛酯片、頭孢呋辛酯膠囊，同時(shí)也適用于檢測(cè)其他不溶于水的酯類藥物中聚合物量，如頭孢卡品酯、頭孢泊肟酯等，為該類脂溶性藥物提供了一種聚合物控制手段。

[1]金少鴻，胡昌勤.β-內(nèi)酰胺類抗生素過敏反應(yīng)的研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志，1994，4（3）:38.

[2]胡昌勤，金少鴻.β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)及其分析技術(shù)研究進(jìn)展 [J].國外醫(yī)藥·抗生素分冊(cè)，1996，17（5）:336.

[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:二部[S].北京:北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005:142.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:二部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:191.

[5]The United Statespharmacopeia convention.United States pharmacopeia 32-NF27[S].2009∶1863.

[6]Japanese pharmacopeiaⅩⅤ[S].2006∶474.

[7]European directorate for quality medicines.European Pharmacopeia 6.0[S].2008∶1463.