氟他胺大鼠在體腸吸收動力學(xué)研究

馬露露 ，張廣軍 ，高保安 ，2，陳建明 ，2?

1第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，上海 200433；2天津天士力制藥股份有限公司，天津 300410

氟他胺是一種非類固醇雄性激素拮抗劑，屬?；桨奉?，是前列腺癌的一線治療藥物。目前氟他胺市售制劑為氟他胺片和膠囊，規(guī)格為250 mg/片（粒），每日服用3次。由于普通制劑的峰谷效應(yīng)、服藥次數(shù)多等因素，氟他胺的毒副作用和患者依從性差等問題很突出[1-2]。故研究開發(fā)氟他胺緩釋片，解決現(xiàn)有制劑存在的問題、提高氟他胺片劑的療效和用藥安全非常必要。

本文采用大鼠在體灌注法建立了氟他胺大鼠小腸吸收模型，通過考察藥物在不同腸段、不同藥物濃度、不同聚山梨酯-80濃度的供試液中的吸收特征，研究藥物的吸收部位、吸收機(jī)制及影響吸收的因素，以期為氟他胺緩控釋制劑的研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器

JA5003N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Agilent1100型高效液相色譜儀、G1314A型紫外檢測器、Agilent化學(xué)工作站（Agilent，美國）；UV1102Ⅱ型紫外分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

氟他胺原料藥（Flutamide，F(xiàn)LU，江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，批號20110808，純度98.6%）；氟他胺對照品（中國藥品生物制品檢定所）；酚紅、烏拉坦（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Krebs-Ringer’s緩沖液（K-R緩沖液，自配，每1000 mL含NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、MgCl20.22 g、NaH2PO40.22 g、葡萄糖 1.4 g、NaHCO31.37 g）；甲醇（色譜純）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

雄性SD大鼠，體重200～220 g，動物合格證號:SCXK（滬）2012-0002，由第二軍醫(yī)大學(xué)動物試驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

供試藥液Ⅰ:精密稱取適量氟他胺、聚山梨酯-80，用K-R緩沖液溶解并稀釋成氟他胺濃度約為30 μg·mL-1含 1%聚山梨酯-80的溶液。

供試藥液Ⅱ:精密稱取適量酚紅、氟他胺、聚山梨酯-80，用K-R緩沖液溶解并稀釋成酚紅濃度約為 20 μg·mL-1、氟他胺濃度約為 30 μg·mL-1含 1%聚山梨酯-80的溶液。

2.2 酚紅與氟他胺含量測定法及測定波長的選擇[3]酚紅的吸收峰在558 nm波長處，氟他胺及聚

山梨酯-80均無吸收，而在氟他胺的吸收峰227 nm波長處，酚紅和聚山梨酯-80對其測定有干擾。故以紫外可見分光光度法于558 nm波長處測定酚紅的濃度，采用HPLC法于227nm處測定氟他胺的濃度。

2.3 腸循環(huán)液中酚紅濃度的測定

2.3.1 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)方法[4]繪制酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度（A）對酚紅質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.017C-0.001（r=0.9997，n=6）。低、中、高（10、30、50 μg·mL-1）3 種濃度的方法回收率分別為100.2%、100.5%、99.8%，日內(nèi)及日間RSD均小于2%。

2.3.2 酚紅濃度的測定 在不同時間點(diǎn)取大鼠在體腸循環(huán)液，12000 r·min-1離心5 min，移取上清液0.5 mL，加入0.2 mol·L-1NaOH溶液5 mL中顯色，立即在波長558 nm處測定吸光度，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得酚紅濃度。

2.4 腸循環(huán)液中氟他胺濃度的測定

2.4.1 色譜條件[5]色譜柱:Diamonsil C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相:甲醇-水（60∶40）；檢測波長:227 nm；流速:1 mL·min-1；柱溫:30℃；進(jìn)樣體積:20 μL。

分別取氟他胺對照品甲醇溶液、空白腸循環(huán)液及在體腸循環(huán)后氟他胺樣品液，在上述色譜條件下測定。圖1結(jié)果表明，氟他胺的保留時間約為25.6 min，樣品液的主峰保留時間與氟他胺對照液一致，且空白液對藥物的測定無干擾。藥物的分離度和理論塔板數(shù)均符合要求。

圖1 氟他胺的HPLC圖譜

2.4.2 氟他胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取氟他胺對照品，用甲醇配成200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)母液，然后準(zhǔn)確吸取適量，用甲醇配成濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件取 20 μL 進(jìn)樣，以濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=40.22C-7.098（r=0.9999，n=6）。用 K-R 緩沖液配制低、中、高（2.5、20、80 μg·mL-1）3 個濃度氟他胺溶液（均含1%聚山梨酯-80），取 20 μL進(jìn)樣，以測得濃度和理論濃度比較，計(jì)算方法回收率。低、中、高3個濃度氟他胺溶液的平均回收率為（99.98±1.09）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.09%，方法回收率較好。低、中、高3個濃度日內(nèi)精密度的RSD值分別為2.77%、1.98%、1.23%（n=6）；日間精密度的RSD值分別為2.74%、2.03%、1.77%（n=6）；該方法的精密度較好。

2.4.3 腸循環(huán)液中氟他胺濃度的測定 在不同時間點(diǎn)取大鼠在體腸循環(huán)液，12000 r·min-1離心 5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，將得到的峰面積值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算氟他胺的濃度。

2.5 氟他胺大鼠在體腸道吸收實(shí)驗(yàn)

2.5.1 藥物在空白K-R緩沖液中的穩(wěn)定性考察用空白K-R緩沖液配制3份藥液，濃度分別為58.39、28.91、14.52 μg·mL-1（均含 1%聚山梨酯-80），置（37±0.5）℃水浴中孵育，分別于 2 h、6 h 取樣并測定孵育前后的藥物濃度，考察藥物在空白K-R緩沖液中的穩(wěn)定性，結(jié)果基本沒有變化，表明氟他胺在空白K-R緩沖液中具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.2 腸壁物理吸附的影響 剪取清洗后的大鼠腸段約10 cm（共4段，分別為十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸），用玻璃棒將黏膜層翻出，置50 mL已知濃度的供試藥液Ⅰ（37±0.5）℃中孵育，分別于2 h、6 h取樣并測定孵育前后的藥物濃度，考察大鼠腸壁對藥物的物理吸附，結(jié)果基本沒有變化，表明大鼠腸壁對藥物基本無物理吸附。

2.5.3 在體全腸段吸收實(shí)驗(yàn) 參照大鼠在體循環(huán)實(shí)驗(yàn)方法[6-7]。選實(shí)驗(yàn)前禁食16 h（自由飲水）的大鼠4只，腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.6 mL/100 g）麻醉，然后固定在手術(shù)臺板上，沿腹中線剪開腹部，結(jié)扎膽管。自十二指腸最上端及回腸最下端各插入一玻璃插管，扎緊，用37℃生理鹽水洗凈腸內(nèi)容物，用空白K-R緩沖液以1 mL·min-1流速平衡30min，排空回流液，改用200 mL供試藥液Ⅱ（含酚紅20 μg·mL-1），以流速 1 mL·min-1回流，分別于 0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h 取樣 2 mL（同時補(bǔ)加 2 mL 空白 K-R緩沖液）按“2.3.2”與“2.4.3”項(xiàng)下操作，計(jì)算得到酚紅與氟他胺的濃度。在體小腸循環(huán)6 h后，4只大鼠分別約有40%的藥物被腸道吸收。

測得循環(huán)藥液中氟他胺的剩余量:X=C×V

C∶腸循環(huán)液中氟他胺濃度；V:利用酚紅濃度計(jì)算得到的腸循環(huán)液體積。

初始藥量為 X0，其吸收百分率[8]（%）=（X0-X）/X0×100%

以小腸內(nèi)剩余藥量的對數(shù)（LnX）對取樣時間t作圖[9-10]，得一直線 Y=-0.096X+8.875（r=0.9998，n=4），且剩余藥量的對數(shù)值隨時間線性下降，說明氟他胺在小腸中的吸收呈現(xiàn)一級動力學(xué)過程，求得吸收速率常數(shù) Ka=（0.965±0.017）h-1。見表 1。

表1 氟他胺在大鼠小腸段的累積吸收百分率（±s，n=4）

表1 氟他胺在大鼠小腸段的累積吸收百分率（±s，n=4）

2.5.4 在體分腸段循環(huán)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前禁食16 h（自由飲水）的大鼠16只，腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.6 mL/100 g）麻醉后固定在手術(shù)臺板上，沿腹中線剪開腹部，選擇所要考察的腸段:自幽門向下取10 cm為十二指腸段；距幽門15 cm處向下取10 cm為空腸段；距盲腸20 cm處向上取10 cm為回腸段；從盲腸向下取10 cm為結(jié)腸段。在各腸段兩端剪切后插管，結(jié)扎。

實(shí)驗(yàn)開始后先用37℃生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，充分洗滌后，再送入空氣使洗滌液盡量排盡。然后用37℃空白K-R緩沖液以1 mL·min-1平衡10～20 min，再用空氣排出回流液，接著用50 mL供試藥液Ⅱ回流2 h，流速1 mL·min-1。結(jié)束后，用空氣排出藥液，將所得回流液移入100 mL量瓶中，另用空白K-R緩沖液沖洗腸道5 min后，并入量瓶。用空白K-R緩沖液定容，混勻。樣品溶液離心后，取上清液20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氟他胺濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將腸段沿插管兩端剪下，測量腸段長度L，求算單位吸收量和單位吸收率，以腸壁通透系數(shù)Ke表示腸壁通透性。

式中m0、m分別為初始藥量和終末藥量，L為腸段長度，t為循環(huán)時間，V為循環(huán)液體積。

藥物在大鼠不同腸段的累積吸收量、吸收百分率和腸壁通透系數(shù)見表2。對氟他胺在大鼠各腸段的吸收結(jié)果進(jìn)行方差分析，表明其在十二指腸、空腸、回腸以及結(jié)腸四個腸段的吸收百分率和腸壁通透系數(shù)均無顯著性差異（α=0.05，P＞0.05），說明氟他胺在整個腸段均有吸收。

表2 藥物在不同腸段的累積吸收量、吸收百分率和腸壁通透系數(shù)（±s，n=4）

表2 藥物在不同腸段的累積吸收量、吸收百分率和腸壁通透系數(shù)（±s，n=4）

腸壁通透系數(shù)Ke（cm2·h-1）0.587±0.2080.571±0.1930.593±0.1970.539±0.192

2.5.5 藥物濃度對腸吸收影響的考察 分別選用濃度為 15.48、35.18、68.48 μg·mL-1的供試藥液（KR緩沖液配制，均含1%聚山梨酯-80），進(jìn)行回流實(shí)驗(yàn)，其它步驟同“2.5.3”項(xiàng)，考察藥物濃度對吸收的影響。不同藥物濃度（15.48～68.48 μg·mL-1）供試液在大鼠腸內(nèi)的吸收速率常數(shù)（Ka，h-1）為（0.092±0.010）～（0.090±0.012）；6h 的吸收百分率（%）為（38.07±1.76）～（42.80±3.37）。

對不同藥物濃度的吸收速率常數(shù)和吸收百分率進(jìn)行方差分析表明，不同藥物濃度的吸收速率常數(shù)和吸收百分率均無顯著性差異（α=0.05，P＞0.05），說明藥物的吸收速率常數(shù)和吸收百分率與濃度無關(guān)，藥物吸收量與濃度呈正比關(guān)系，符合Ficks擴(kuò)散原理。說明氟他胺的小腸吸收機(jī)制為被動擴(kuò)散。

2.5.6 聚山梨酯-80濃度對腸吸收影響的考察 分別選用聚山梨酯-80為1%、2%、5%的供試藥液（KR 緩沖液配制，氟他胺濃度為 30 μg·mL-1），進(jìn)行回流實(shí)驗(yàn)，其它步驟同“2.5.3”項(xiàng)，考察聚山梨酯-80對吸收的影響。

藥物在不同聚山梨酯-80濃度腸循環(huán)液中吸收速率常數(shù)（Ka）和6 h的吸收百分率見表3。由表3可知，不同聚山梨酯-80濃度條件下，小腸的吸收速率常數(shù)和吸收百分率無顯著性差異（α=0.05，P＞0.05）。

表3 不同聚山梨酯-80濃度腸循環(huán)液中氟他胺的吸收速率常數(shù)和吸收百分率（±s，n=4）

表3 不同聚山梨酯-80濃度腸循環(huán)液中氟他胺的吸收速率常數(shù)和吸收百分率（±s，n=4）

3 討 論

評價藥物腸吸收動力學(xué)的方法可分為3類:體外試驗(yàn)法、在體試驗(yàn)法、體內(nèi)試驗(yàn)法[10]。其中在體試驗(yàn)法不切斷血管與神經(jīng)，且能夠避免胃內(nèi)容物排出及消化道固有運(yùn)動的生理影響[11]，較為真實(shí)地反映藥物的吸收情況，藥物在大鼠體內(nèi)吸收與人體內(nèi)吸收存在高度相關(guān)性[12]。故在體試驗(yàn)法是目前常用的一種方法。

氟他胺在腸道內(nèi)無特定吸收部位，各腸段的吸收速率常數(shù)無顯著性差異，提示氟他胺可以制成緩、控釋制劑。不同藥物濃度條件下，小腸的吸收速率常數(shù)Ka之間無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的聚山梨酯-80的濃度（1%～5%）對藥物的吸收無影響。全腸段吸收實(shí)驗(yàn)中，剩余藥量的自然對數(shù)與循環(huán)時間成線性關(guān)系，所得直線的相關(guān)系數(shù)r＞0.9，表明吸收動力學(xué)為一級吸收，吸收機(jī)制為被動擴(kuò)散。了解藥物的小腸吸收特性，可以更好地指導(dǎo)藥物的劑型設(shè)計(jì)，所以氟他胺的小腸吸收研究對于以后控緩釋劑型的設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義。

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