乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)γ-氨基丁酸最適條件的研究

楊麗麗，趙城彬，吳 非

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)γ-氨基丁酸最適條件的研究

楊麗麗，趙城彬，吳 非*

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

使用乳酸菌發(fā)酵米糠，以菌種、菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為單因素研究其對米糠發(fā)酵液中γ-氨基丁酸（GABA）含量的影響，在最適條件下，采用混料設(shè)計法，使用混合乳酸菌發(fā)酵米糠，以發(fā)酵液中GABA含量為指標，確定乳酸菌發(fā)酵米糠的最優(yōu)條件為：在混合菌種嗜熱鏈球菌S1添加量為1.55%，保加利亞乳桿菌L1添加量為1.45%，50℃下發(fā)酵米糠14h，發(fā)酵液中GABA含量最高，為287.975mg/100g。

米糠，乳酸菌，γ-氨基丁酸（GABA）

Abstract：Lactobacillus were used to ferment rice bran.Strains，adding amount of strains，fermentation temperature and fermentation time were used as single factorand their influence on the production of GABA of the fermented rice bran were researched.The mixture design method were used to determine the optimum conditions and mixed lactobacillus were used to fermente rice bran with the number of GABA content for index，lactobacillus ferments rice bran optimal conditions were investigated，the result showed：in the mixed bacteria streptococcus thermophilus cultured S1 add content was 1.55% ，Bulgaria lactobacillus L1 add content was 1.45% ，50℃fermented rice bran 14h，the number of GABA content was highest for 287.975mg/100g.

Key words：rice bran；Lactic acid bacteria；GABA

米糠是稻米碾白加工過程中碾下的皮層、米胚和碎米混合物，米糠中蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸組成豐富，營養(yǎng)全面。尤其是谷氨酸（Glu）的含量很高[1]。Glu為合成γ-氨基丁酸（GABA）的重要原料。GABA作為人體重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、改善腦部血液循環(huán)、安神、健腎、利肝和改善脂質(zhì)代謝等生理作用[2-7]。γ-氨基丁酸同其A型受體在胃癌SGC-7901細胞的表達及其對細胞增殖的影響、γ-氨基丁酸脂質(zhì)體制備工藝的研究、富γ-氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵功能飲料的研制是近些年營養(yǎng)界和醫(yī)療界共同關(guān)注和研究的一個熱點課題。GABA天然存在量低，很難從一些天然動植物組織中大量提取分離。目前獲得GABA的方法有化學合成法和生物法兩大類，其中生物法包括植物富集法和微生物發(fā)酵法2種[8-9]。由于使用具有食品安全的微生物乳酸菌中的谷氨酸脫羧酶催化生產(chǎn)GABA，具有不受資源、環(huán)境和空間的限制等優(yōu)點，而且乳酸菌是一種具有保健作用的益生菌，與食品工藝的關(guān)系密切，因此使用乳酸菌發(fā)酵米糠具有雙重的經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠 東北農(nóng)業(yè)大學實驗室提供；副干酪乳桿菌1.0201、嗜熱鏈球菌S1、保加利亞乳桿菌L1 東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室提供；GABA標準品 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

722可見光分光光度計 天津市泰斯特儀器有限公司；pHS-25型pH計 上海精科雷磁儀器廠；JD500-2型分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；HH-4型電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；高速離心機 天津市泰斯特儀器有限公司；超凈工作臺 北京安泰科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌活化 從冷凍保存的3種菌株的凍存管中各取300μL菌液分別接入10mL MRS液體培養(yǎng)基中，40℃下活化培養(yǎng)24h，然后分別吸取1.5mL菌液于50mL MRS培養(yǎng)基中，40℃下培養(yǎng)18h，再分別吸取3mL菌液于100mL MRS培養(yǎng)基中，40℃下培養(yǎng)16h作為種子液。

1.2.2 GABA含量的測定 準確稱量GABA 2500.000mg于500mL容量瓶中用蒸餾水溶解、定容為5.00mg/mL標準溶液，使用時準確配制0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL的GABA標準溶液系列。然后分別從配制好的0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL的GABA標準溶液中取出1.00mL，再依次加入0.01mol/L四硼酸鈉緩沖液1.0mL，6%苯酚溶液1.0mL，7.5%次氯酸鈉溶液1mL，混勻，沸水浴10min，立即冰浴5min，待溶液出現(xiàn)藍綠色后，加入60%乙醇溶液2.0mL后于645nm下測定吸光值。以吸光值為縱坐標，各標準溶液濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，并建立回歸方程。樣品發(fā)酵后，在12000r/min下離心15min，取發(fā)酵米糠上清液1.00mL進行比色法測定，測定方法同標準曲線的繪制時所用方法。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵米糠條件的優(yōu)化 分別稱取1g米糠于3只15mL發(fā)酵管中，分別加入10mL蒸餾水混勻，放入高壓蒸汽滅菌鍋中115℃滅菌15min，待試管溫度降至30℃左右時，在無菌超凈臺中接入種子液進行發(fā)酵。

1.2.3.1 發(fā)酵溫度對GABA產(chǎn)量的影響 在菌種添加量為2%的條件下，用副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠，設(shè)定發(fā)酵溫度分別為35、40、45、50、55℃，在此條件下發(fā)酵12h，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3.2 發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量的影響 在菌種添加量為2%、發(fā)酵液溫度50℃的條件下，用副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠，分別發(fā)酵10、12、14、16、18h，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取最佳發(fā)酵時間。

1.2.3.3 菌種添加量對GABA產(chǎn)量的影響 以副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠，在發(fā)酵液溫度50℃，菌種的添加量分別1%、2%、3%、4%、5%的條件下發(fā)酵14h，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取菌種最佳添加量。

1.2.3.4 乳酸菌類型對GABA產(chǎn)量的影響 在菌種添加量為3%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間14h的條件下，分別使用副干酪乳桿菌1.0201、嗜熱鏈球菌S1、保加利亞乳桿菌L1發(fā)酵米糠，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取最佳發(fā)酵菌種。

1.2.3.5 混合乳酸菌對GABA產(chǎn)量的影響 在單因素實驗的基礎(chǔ)上以發(fā)酵溫度50℃、發(fā)酵時間14h、混合菌種添加量3%為固定參數(shù)，采用混料設(shè)計實驗[10-12]，使用混合乳酸菌發(fā)酵米糠，以A（副干酪乳桿菌添加量，%）、B（嗜熱鏈球菌添加量，%）、C（保加利亞乳桿菌添加量，%）分別代表的因素為自變量，以GABA含量為因變量，來確定混合乳酸菌的配比的因素水平編碼表，見表1。

1.2.3.6 驗證實驗 通過對混合菌不同配比發(fā)酵參數(shù)對考察指標影響的混料實驗研究，得到了產(chǎn)GABA的優(yōu)化值。在考察指標最優(yōu)的混合菌發(fā)酵工藝條件下，進行5次驗證實驗取平均值，比對在最優(yōu)混合菌發(fā)酵條件下各考察指標的驗證值與預測值之間的標準偏差是否在合理范圍內(nèi)。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.4 統(tǒng)計分析 單因素實驗運用Excel進行數(shù)據(jù)繪圖分析；混料設(shè)計使用Design Expert進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的研究

實驗標準曲線、發(fā)酵溫度、時間、菌種添加量對副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠發(fā)酵液中GABA含量的影響的測定結(jié)果分別見圖1～圖4。

圖1 GABA標準曲線Fig.1 GABA standard curve

圖2 溫度對GABA含量的影響Fig.2 The influence of temperature on GABA content

圖3 時間對GABA含量的影響Fig.3 The influence of time on GABA content

圖4 菌種添加量對GABA含量的影響Fig.4 The influence of adding amount of strains on GABA content

圖1經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，GABA標準曲線的回歸方程為y=0.6993x-0.0418，相關(guān)系數(shù)R2=0.9982；圖2發(fā)酵溫度對GABA產(chǎn)量影響的結(jié)果為，50℃時發(fā)酵液中GABA含量最高，達248.55mg/100g；圖3發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量影響的結(jié)果為，14h發(fā)酵液中GABA含量最高，達268.55mg/100g；圖4菌種的添加量對GABA產(chǎn)量影響的結(jié)果，可以看出其添加量為3%時發(fā)酵液中GABA含量最高，達277.13mg/100g。

2.2 乳酸菌類型發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的研究

在菌種添加量為3%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間14h的條件下，三種乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的研究結(jié)果見圖5。

圖5 乳酸菌類型對GABA產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence on GABA production of Lactic acid bacteria types

由圖5可以看出，三種乳酸菌發(fā)酵米糠中，保加利亞乳桿菌L1發(fā)酵液中GABA含量最高，達282.85mg/100g。

2.3 混合乳酸菌對GABA產(chǎn)量的影響

混料設(shè)計實驗結(jié)果見表2。

表2 混料設(shè)計結(jié)果Table 2 Mixture design results

通過統(tǒng)計分析軟件Design Expert進行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型如下：

回歸方程可信度分析見表3。其中，R2=0.9156，表明實驗數(shù)據(jù)可用該模型進行解釋，說明方程可靠性較高。CV值越低，顯示實驗穩(wěn)定性越好。該實驗的CV值為2.76%，較低，說明實驗操作可信。

表3 回歸方程可信度及方差分析結(jié)果Table 3 Creditability of regression equations

采用Design-Expert軟件對模型方程進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 4 Regression equation of the results of variance analysis

由表4可知，線性混合對R值的影響顯著（“Prob＞F”值＜0.05），表明方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯。然而AC和BC對響應(yīng)值影響也顯著，說明實驗因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。該模型回歸顯著（“Prob＞F”值＜0.05），失擬項不顯著（“Prob＞F”值＞0.05），說明該模型能很好地擬合各指標與混合菌比例。由F檢驗可以得到因子貢獻率為：BC＞AC＞AB，即嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌混合作用發(fā)酵＞副干酪乳桿菌與保加利亞乳桿菌混合作用發(fā)酵＞副干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合作用發(fā)酵。

混料設(shè)計優(yōu)化結(jié)果與響應(yīng)面分析圖，見圖6～圖7。

圖6 混料設(shè)計優(yōu)化結(jié)果圖Fig.6 Optimization results of mixing design

圖7 響應(yīng)面分析結(jié)果Fig.7 The response surface GABA

響應(yīng)面可以直接反映出各因子對響應(yīng)值的影響大小，通過優(yōu)化結(jié)果可以直接看出最優(yōu)條件下各因子的取值范圍。由圖7以及表4可知，副干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合作用發(fā)酵對GABA含量的提高不明顯，通過混料設(shè)計結(jié)果的優(yōu)化和響應(yīng)面分析可知，在本實驗條件下，副干酪乳桿菌添加量X（A）、嗜熱鏈球菌添加量X2（B）和保加利亞乳桿菌添加量X3（C）對應(yīng)的編碼值分別為0、0.516和0.484時，GABA含量有較大值在296.893mg/100g左右。與其對應(yīng)的混合菌種最佳添加量為：嗜熱鏈球菌添加量為1.55%，保加利亞乳桿菌添加量為1.45%。

2.4 驗證實驗

通過混合菌不同配比參數(shù)對各考察指標影響的混料實驗研究，得到了乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的優(yōu)化值。在混合乳酸菌的最優(yōu)配比條件下，進行5次驗證實驗取平均值，結(jié)果為各考察指標的驗證值287.975mg/100g與預測值296.893mg/100g之間的標準偏差均在合理范圍內(nèi)，說明響應(yīng)值的驗證實驗值與回歸方程預測值吻合良好。

3 結(jié)論

由單因素對GABA產(chǎn)量的影響的實驗結(jié)果可知，在菌種添加量為3%、發(fā)酵溫度50℃、發(fā)酵時間14h的條件下，保加利亞乳桿菌L1發(fā)酵液中GABA含量最高，達282.85mg/100g。而在同等條件下，利用混料設(shè)計后混合乳酸菌發(fā)酵米糠以嗜熱鏈球菌S1添加量為1.55%，保加利亞乳桿菌L1添加量為1.45%時，最終發(fā)酵液中GABA含量達287.975mg/100g，高于任何單一菌液發(fā)酵米糠時發(fā)酵液中GABA的產(chǎn)量，即在混合菌同時使用時GABA的含量得到了進一步的富集，實現(xiàn)了高產(chǎn)的目的。

米糠價格低廉，發(fā)酵工藝簡單，生產(chǎn)周期短，其發(fā)酵產(chǎn)物可進行后續(xù)處理，如GABA的提取或者富含GABA食品的開發(fā)等，預期會具有較好的市場前景。

[1]嚴聃.發(fā)酵法從米糠中提取高濃度γ-氨基丁酸粉末的工藝研究[J].湖南科技學院學報，2009，30（4）：89.

[2]V Satya Narayan，P M Nair.Metabolism enzymology and possible roles of 4-aminobutyric acid[J].Biochemistry，1989（8）：21-25.

[3]KiBum Park，SukHeung OH.Production of yogurt with enhanced levels of gamma-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract[J].Bioresource Technology，2007，98：1675-1679.

[4]林智，大森正司.γ-氨基丁酸茶降血壓機理的研究[J].茶葉科學，2001，21（2）：153-156.

[5]林智，大森正司.γ-氨基丁酸茶成分對大鼠血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶（ACE）活性的影響[J].茶葉科學，2002，22（1）：43-46.

[6]HaiYuan，B Richard，Silverman.New substrates and inhibitors of γ-aminobutyric acid aminotransferase containing bioisosteres of the carboxylic acid group：Design，synthesis，and biological activity[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2006（14）：1331-1338.

[7]張暉，姚惠源，姜元榮.富含γ-氨基丁酸保健食品研究開發(fā)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（9）：69-71.

[8]劉清，姚惠源，張暉.生產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源，2004，26（1）：21-25.

[9]NorikoKomatsuzak， Jun Shima， ShinichiKawamoto， et al.Production of γ-amionbutyric acid by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods[J].Food&Microbiology，2005（22）：497-504.

[10]張彩，童華榮，章道明，等.植物蛋白飲料配方優(yōu)化研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2006，28（2）：197-200.

[11]童華榮，龔正禮.茶葉拼配的混料設(shè)計研究[J].茶葉科學，2004，24（3）：207-211.

[12]劉春光，周建斌，陳竹君.混料實驗設(shè)計在肥料配比研究中的應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2001，29（1）：59-62.

Study on Lactobacillus fermentation in rice bran production gamma-aminobutyric optimal conditions

YANG Li-li，ZHAO Cheng-bin，WU Fei*
（Institute of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

TS210.1

A

1002-0306（2012）16-0217-04

2011-12-01 *通訊聯(lián)系人

楊麗麗（1985-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

黑龍江省自然科學基金項目（C200942）。