南極磷蝦脂質(zhì)提取方法的比較

孫甜甜，薛長湖，薛 勇，左 濤，岳榮巖

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

南極磷蝦脂質(zhì)提取方法的比較

孫甜甜，薛長湖*，薛 勇，左 濤，岳榮巖

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

實驗分別比較了氯仿甲醇、正己烷和95%乙醇三種不同溶劑以及超臨界CO2提取的南極磷蝦脂質(zhì)成分差異，為南極磷蝦脂質(zhì)的研究提供一定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，氯仿甲醇提取的脂質(zhì)得率最高，為19.21%±0.59%。正己烷提取的得率最低，僅為14.24%±0.38%，甘油三酯和膽固醇含量最高，分別為46.98%±1.00%和3.68%±0.30%，但對極性脂的提取效果不理想，磷脂含量僅為19.20%±3.45%。95%乙醇提取的脂質(zhì)磷脂含量35.59%±2.69%，不飽和脂肪酸中EPA和DHA含量是最高的，占總脂肪酸含量的41.13%，且95%乙醇安全性高，價格低廉，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，可以作進一步的探討。超臨界CO2萃取技術(shù)作為脂質(zhì)的一種溫和提取手段，得到的脂質(zhì)基本成分與氯仿甲醇近似，雖然安全性更高，但是超臨界設(shè)備成本較高，不適于中小型企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)。

南極磷蝦脂質(zhì)，氯仿甲醇，95%乙醇，正己烷，超臨界CO2，成分差異

Abstract：In order to provide certain base for the Antarctic krill lipid research the lipid difference of Antarctic krill by using chloroform methanol，95%ethanol，hexane method and supercritical CO2were discussed.The result showed that the content of lipid using chloroform methanol was the highest，about 19.21%±0.59%.The content of lipid using hexane was the lowest and its triglycerides and cholesterol content was about 46.98%±1.00%and 3.68%±0.30%respectively.But the extraction efficiency of polarity lipid using hexane was not ideal as it contained only 19.20%±3.45%phospholipids.The content of polarity lipid using 95%ethanol was relatively higher which included 35.59%±2.69%phospholipids，and the content of EPA and DHA was the highest which included 41.13%of the total lipids.And 95%ethanol method was more safety and cheaper，so it was suitable for large-scale industrialized production and could be further discussed.The lipid extracted by supercritical CO2technology which was a mild methods for of lipid extraction was approximate with chloroform methanol.Supercritical CO2extraction technology was more secure，but the high cost of supercritical equipment was not suitable for the industrial production of small and medium-sized enterprises.

Key words：Antarctickrilllipid；chloroformmethanol；95%ethanol；hexane；supercriticalCO2；componentdifference

南極磷蝦（Euphausia superba），是一種生活在南極洲水域的甲殼類浮游動物，個體較小，一般3～5cm，其生物資源十分豐富，是迄今人類發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)含量最高的生物。據(jù)測定，南極磷蝦肌肉鮮樣中含粗蛋白16.31%，不僅含人體所必需的全部氨基酸，而且必需氨基酸之間的比例適宜，更有利于人體吸收，營養(yǎng)價值十分豐富[1]。南極磷蝦中還含有豐富的ω-3系列的多不飽和脂肪酸，例如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），還富含常作為功能食品的磷脂類、類黃酮、維生素A、維生素E、蝦青素等[2]。從南極磷蝦中提取的脂質(zhì)具有降血脂、降血壓、抗氧化、減肥等保健功能。與傳統(tǒng)的魚類脂質(zhì)相比，南極磷蝦脂質(zhì)在人體中具有更好的吸收性，且經(jīng)測定，南極磷蝦的脂質(zhì)不會產(chǎn)生任何毒副作用，保健功效更加全面，是一種發(fā)展前景十分廣闊的功能性食品[3-4]。目前提取南極磷蝦脂質(zhì)主要有以下方法：a.有機溶劑萃取。利用有機溶劑從動植物組織中提取脂質(zhì)是應(yīng)用最廣泛的方法。南極磷蝦脂質(zhì)的提取多使用乙醇、丙酮、石油醚、正己烷、乙酸乙酯等毒性較低的有機溶劑。b.超臨界CO2萃取法。近年來，超臨界萃取作為一種新興技術(shù)受到了人們的重視。CO2具有無毒、價廉易得、臨界溫度接近室溫并且臨界壓力不太高等優(yōu)點，成為最常用的超臨界萃取溶劑。超臨界CO2萃取是一種溫和的脂質(zhì)提取方法，在南極磷蝦提取方面還處于研究階段，而且目前對南極磷蝦脂質(zhì)提取方面的報道較少，本研究主要利用了氯仿甲醇、正己烷和95%乙醇三種不同溶劑及超臨界CO2技術(shù)提取南極磷蝦脂質(zhì)，比較了不同提取方法得到的脂質(zhì)成分的差異，為南極磷蝦脂質(zhì)的研究提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 日本水產(chǎn)株式會社提供，冷凍方式運至實驗室，并貯藏于-30℃冰柜，粉碎；甘油三酯試劑盒、總膽固醇試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；正己烷、氯仿、甲醇、95%乙醇、石油醚、無水硫酸鈉、氯化鈉、濃硝酸、高氯酸等 均為分析純。

BS210S型電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；JB-1A磁力攪拌器、721型分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SFE121-50-02超臨界萃取裝置江蘇南通華興石油儀器有限公司；6980N型氣相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦脂質(zhì)的溶劑提取 稱取三份10g粉碎的南極磷蝦，分別加入氯仿/甲醇（2∶1，V∶V）、95%乙醇、正己烷各150mL，浸提溫度均為25℃，中等轉(zhuǎn)速攪拌浸提4h。過濾后用少量提取溶劑沖洗濾渣，合并濾液。正己烷和95%乙醇提取后的濾液直接真空旋蒸，操作溫度分別為40、45℃。氯仿/甲醇法提取的濾液中要加入35mL的0.9%氯化鈉溶液，振蕩搖勻后靜置過夜，溶液明顯分層，收集下層氯仿層，通過無水硫酸鈉脫水后移至旋蒸瓶中，于40℃下真空旋蒸。

1.2.2 南極磷蝦脂質(zhì)的超臨界CO2提取 本實驗采用的是1L超臨界CO2萃取裝置，該裝置所用容器材質(zhì)均為不銹鋼，溫度控制采用循環(huán)水浴，壓力由調(diào)節(jié)閥控制。稱取三份100g粉碎的南極磷蝦，采用25MPa的壓力，50℃的萃取溫度，分別萃取1、2、3h，CO2流量為20L/h，極性夾帶劑（如95%乙醇）萃取。收集分離器中得到的液體，過濾除去雜質(zhì)后濾液于45℃下真空旋蒸。

1.2.3 分析方法 總脂測定：重量法；甘油三酯和總膽固醇測定：試劑盒測定；磷脂含量測定：GB/T 5537-2008第一法鉬藍比色法；游離脂肪酸測定：銅皂比色法[5]；過氧化值（POV值）測定：GB/T 5009.37-2003第二法比色法；脂肪酸組成測定：氣相色譜法。

1.3 測定條件

1.3.1 磷脂含量測定條件 取0.1～0.2g提取的南極磷蝦脂質(zhì)，先用20mL混合酸（濃硝酸∶高氯酸=4∶1，V∶V）浸泡，冷消化2h，然后進行濕法消化[6]。將消化好的溶液用超純水定容至50mL容量瓶中，再采用GB/T 5537-2008第一法鉬藍比色法測定磷脂含量。

1.3.2 游離脂肪酸測定條件 游離脂肪酸測定是采用改良的銅皂比色法，游離脂肪酸與銅離子形成銅皂，經(jīng)有機溶劑萃取后可進行比色測定，銅皂在715nm附近有較強吸收峰，根據(jù)吸光度的大小判斷游離脂肪酸的含量。

銅試劑：5g乙酸銅溶解于100mL蒸餾水中，過濾后加入吡啶調(diào)節(jié)pH至6.1，暗處保存。

標準曲線的測定：取0.5g左右油酸，用氯仿定容至100mL，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL離心管中，氮氣吹干，加入3mL正庚烷溶解，振蕩1min后加入1mL銅試劑，振蕩2min，靜置10min后于715nm處測OD值。繪制標準曲線。

樣品測定：稱取0.1g脂質(zhì)，用氯仿定容至50mL，取1mL置于10mL離心管中，氮氣吹干，加入3mL正庚烷溶解，振蕩1min后加入1mL銅試劑，振蕩2min，靜置10min后于715nm處測定OD值。根據(jù)標準曲線計算脂質(zhì)中的游離脂肪酸含量（以油酸計）。

1.3.3 氣相色譜法條件[7]氣相色譜分析：取50mg左右提取的脂質(zhì)，加入1.5mL的10%硫酸-甲醇溶液，于60℃充氮保護反應(yīng)30min，待冷卻后加入1.5mL石油醚振蕩提取，靜置10min。取上層石油醚溶液過0.22μm的有機膜，過膜后取1μL做氣相色譜分析。

氣相色譜條件：氣相色譜儀為Agilent 6890N型氣相色譜儀，進樣口為分流/不分流進樣口，色譜柱為INNOWax石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm，J&W），檢測器采用FID檢測器，載氣為高純氮氣，流速為1mL/min；進樣口參數(shù)：進樣口溫度240℃，分流比10∶1，進樣量1μL；FID檢測器參數(shù)：檢測器溫度250℃，氫氣流速40mL/min，空氣流速450mL/min，尾吹氣（氮氣）流速40mL/min；升溫程序：起始溫度170℃，以3℃/min升溫至210℃，保持30min，單個樣品分析過程為43.3min。

1.3.4 得率計算

式中：為得到脂質(zhì)的質(zhì)量（g）；為粉碎的南極磷蝦質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑提取南極磷蝦脂質(zhì)的得率

表1 不同溶劑提取南極磷蝦脂質(zhì)的得率Table 1 Extraction yield of Antarctic krill lipid using different solvents

氯仿甲醇法作為一種標準的定量水產(chǎn)品脂質(zhì)含量的標準方法，可以把樣品中所有的脂溶性完全提取出來，可以作為提取脂質(zhì)分析的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。從表1中可以看出，氯仿甲醇法提取的脂質(zhì)最高，95%乙醇和正己烷都是單一性溶劑，根據(jù)“相似相溶”原理，95%乙醇僅對極性脂提取效率較高，正己烷僅對中性脂提取效率較高，而氯仿甲醇法對中性脂和極性脂的提取效率均較高，所以這兩種溶劑的提取效率不如氯仿甲醇。

2.2 超臨界CO2提取南極磷蝦脂質(zhì)的得率

從表2中可以看出，隨著萃取時間的延長，脂質(zhì)的得率在逐漸升高，萃取3h后，提取率達到17.53%±0.28%，與溶劑萃取法的得率相近。

表2 超臨界CO2提取南極磷蝦脂質(zhì)的得率Table 2 Extraction yield of Antarctic krill lipid using supercritical CO2

三種溶劑提取得到的脂質(zhì)均為深紅色，不透明。其中氯仿甲醇和正己烷得到的脂質(zhì)常溫下流動性較好。而超臨界萃取得到的脂質(zhì)顏色為深紅色，不透明，有輕微的蝦味，在40℃下流動性較好。

2.3 不同溶劑提取的南極磷蝦脂質(zhì)成分差異

表3 不同溶劑提取的南極磷蝦脂質(zhì)成分差異Table 3 Lipid composition difference of Antarctic krill lipid by different solvents

從表3中可以看出，氯仿甲醇提取南極磷蝦脂質(zhì)的組成主要以甘油三酯、磷脂和游離脂肪酸為主，三者含量達到88.49%。95%乙醇是一種極性溶劑，根據(jù)“相似相溶”原理，主要對脂質(zhì)中的極性脂特別是磷脂類提取效果良好，磷脂含量為35.59%±2.69%，但是甘油三酯和總膽固醇相對其他兩種方法較低。因為南極磷蝦中的磷脂是和EPA和DHA結(jié)合型的，所以磷脂含量高的同時EPA和DHA含量也會高。另外，95%乙醇提取時還會溶出一些水溶性物質(zhì)如蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)等，使脂質(zhì)提取率偏低，還會使游離脂肪酸偏高；正己烷是一種非極性溶劑，對中性脂如甘油三酯、膽固醇的提取效率較高，含量為46.98%±1.00%和3.68%±0.30%，因此流動性也是最好的。但是正己烷對磷脂這類極性脂提取效果不理想，僅有19.20%±3.45%，同時正己烷提取還存在溶劑殘留問題。過氧化值是反映油脂酸敗程度的一個指標，所以游離脂肪酸高的時候POV值也會相應(yīng)較大。三種溶劑雖然提取時間一樣，但是原料中存在一定的水分，在用95%乙醇提取時可能會發(fā)生甘油三酯的水解造成游離脂肪酸偏高，而正己烷和氯仿是一種疏水性溶劑，水分對其提取的影響較小，游離脂肪酸和過氧化值相對較小。

2.4 超臨界CO2提取的南極磷蝦脂質(zhì)基本成分

表4 超臨界CO2萃取南極磷蝦脂質(zhì)基本成分Table 4 Lipid composition of Antarctic krill lipid using supercritical CO2

從表4中可以看出，隨著萃取時間的延長，脂質(zhì)中的各種成分也在增加。在考慮得率、游離脂肪酸含量、磷脂含量、成本、二氧化碳耗用量等各方面指標，超臨界采用25MPa的壓力，50℃的萃取溫度，萃取2h的效果較好，各方面成分接近于氯仿甲醇法。超臨界之后的蝦粉還可以作為高蛋白質(zhì)來源進一步開發(fā)利用。

2.3 脂肪酸組成分析

從表5中可以看出，氯仿甲醇法提取的脂質(zhì)中有45.52%的飽和脂肪酸，其中C16∶0的棕櫚酸含量最高，EPA和DHA總含量為31.11%；95%乙醇法提取的脂質(zhì)中飽和脂肪酸含量為41.76%，EPA和DHA含量相對其他兩種方法是最高的，占總脂肪酸含量的41.13%。這是因為95%乙醇對極性脂的提取效果較好，而EPA和DHA主要存在于南極磷蝦的磷脂這類極性脂中，在甘油三酯等中性脂中基本不存在，這與Joseph C Gigliotti等人[8]的研究結(jié)果是一致的；正己烷法提取的脂質(zhì)EPA和DHA含量與氯仿甲醇法接近，總含量為32.20%，飽和脂肪酸含量占總脂肪酸的45.15%，比95%乙醇略高一些。超臨界CO2萃取得到的脂質(zhì)脂肪酸成分接近于氯仿甲醇法，這是因為CO2和極性夾帶劑的共同作用，將脂質(zhì)中的中性脂和極性脂較完全的提取出來。南極磷蝦脂質(zhì)的脂肪酸主要組成成分與劉麗[2]和樓喬明[7]等人的研究結(jié)果基本相似，但是有一些組分相差較大，這可能與南極磷蝦的來源、性別、生長階段以及捕獲季節(jié)、地點、加工工藝的不同等有關(guān)。

表5 不同溶劑以及超臨界CO2提取的南極磷蝦脂質(zhì)的主要脂肪酸組成（%）Table 5 Lipid fatty acid composition of Antarctic krill lipid using different solvents and supercritical CO2（%）

3 結(jié)論

氯仿甲醇法雖然提取相對完全，可以作為脂質(zhì)提取的標準方法，但是氯仿是一種可疑的致癌物，甲醇則會損害視神經(jīng)，都對操作人員的健康有害。所以氯仿甲醇法一般只是作為實驗室脂質(zhì)提取的一個基礎(chǔ)理論方法，不作為工業(yè)化生產(chǎn)中的方法。正己烷是一種非極性溶劑，對甘油三酯、膽固醇這類中性脂提取效果很好，所以流動性較好，在一些工業(yè)生產(chǎn)中也有應(yīng)用，但是對南極磷蝦中磷脂此類極性脂的提取效率不高，EPA和DHA含量相對較低，同時正己烷是一種低毒性的溶劑，具有高揮發(fā)性、高脂溶性和高蓄積性等特性，長期接觸的話可能會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變，并且在脂質(zhì)中存在溶劑殘留問題。超臨界CO2萃取技術(shù)作為脂質(zhì)的一種溫和提取手段，得到的脂質(zhì)基本成分與氯仿甲醇近似，不用耗費大量的試劑，生產(chǎn)時間縮短，安全性也更高，但是超臨界萃取設(shè)備比較昂貴，前期成本較高，所以不適于中小型企業(yè)進行工業(yè)化生產(chǎn)。從結(jié)果來看，95%乙醇提取南極磷蝦脂質(zhì)可以獲得相對較高的得率，磷脂含量高達35%，不飽和脂肪酸EPA和DHA含量高達41.132%，而且95%乙醇安全無毒，價格低廉，是十分適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的，可以作進一步的探討。

[1]孫雷，周德慶，盛曉風(fēng).南極磷蝦營養(yǎng)評價與安全性研究[J].海洋水產(chǎn)研究，2008，29（2）：57-64.

[2]劉麗，劉承初，趙勇，等.南極磷蝦的營養(yǎng)保健功效以及食用安全性評價[J].食品科學(xué)，2010，31（17）：443-447.

[3]Kevin C Maki，Mathew S Reeves，Mildred Farmer，et al.Krill oil supplementation increases plasma concentrations of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids in overweight and obese men and women[J].Nutrition Research，2009，29：609-615.

[4]王亞恩，姜國良，徐愷，等.南極磷蝦油對高脂血癥大鼠血脂和抗氧化力的影響[J].中國海洋藥物雜志，2011，30（3）：56-59.

[5]馬六通，陳耀華，王景剛.銅皂分光光度法測定豬血清中的微量游離脂肪酸[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1984，（3）：78-85.

[6]黃城，周燕，曾淦寧，等.抗壞血酸-鉬藍分光光度法測定海藻中磷的研究探討[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2009，28（6）：76-78.

[7]樓喬明，王玉明，劉小芳，等.南極磷蝦脂肪酸組成及多不飽和脂肪酸質(zhì)譜特征分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（4）：929-935.

[8]Joseph C Gigliotti，Matthew P Davenport，Sarah K Beamer，et al.Extraction and characterisation of lipids from Antarctic krill（Euphausia superba）[J].Food Chemistry，2011，125：1028-1036.

Comparisons of the Antarctic krill lipid extraction methods

SUN Tian-tian，XUE Chang-hu*，XUE Yong，ZUO Tao，YUE Rong-yan
（College of Food Science and Technology，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

TS254.1

A

1002-0306（2012）16-0115-04

2012-01-05 *通訊聯(lián)系人

孫甜甜（1987-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)化學(xué)。

國家863計劃（2011AA090801）；國家863計劃（2011AA100803）；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項經(jīng)費。