重金屬汞酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

方淑兵，王俊平，王 碩，張 燕，生 威，王 津，楊依錦

（天津科技大學(xué)食品安全管理與戰(zhàn)略研究中心，天津300457）

重金屬汞酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

方淑兵，王俊平*，王 碩，張 燕，生 威，王 津，楊依錦

（天津科技大學(xué)食品安全管理與戰(zhàn)略研究中心，天津300457）

建立了重金屬汞離子的間接競爭酶聯(lián)免疫（IC-ELISA）分析方法。由于汞離子不具有免疫原性，因此以異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）為雙功能螯合劑連接汞離子和鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）作為免疫原，免疫新西蘭大白兔獲得特異性抗體。用獲得的抗體建立汞的ELISA分析方法。檢測限為0.45μg/L，靈敏度為4.10μg/L。特異性實(shí)驗(yàn)表明，抗體對鎳和銅的交叉反應(yīng)率分別為10.8%和13.5%，與其他金屬均無明顯交叉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以白芷、胡蘿卜和皮皮蝦為基質(zhì)，添加回收實(shí)驗(yàn)表明，白芷、胡蘿卜、皮皮蝦回收率均在70%～120%。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，儀器檢測結(jié)果和建立的ELISA分析方法具有很好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)為0.988），表明建立的方法具有很好的準(zhǔn)確性。

汞，酶聯(lián)免疫，多克隆抗體

Abstract：An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（IC-ELISA） was developed for the rapid detection of Hg（II）.As the mercury ion was not immunogenic，so mercury was linked to the keyhole limpet hemocyanin（KLH） with 1-（4-isothiocyanobenzyl） ethylenediamine-N，N，N’，N’-tetraacetic acid（ITCBE） as immunogen.For the developed ELISA，the limit of detection and sensitivity were 0.45μg/L and 4.10μg/L，respectively.The cross-reactivity against other metals were all low，except for copper and nickel，which had10.8%，13.5%corss-reactivity，respectively.The recoveries of dahurica，carrot and Pipi shrimp sample were ranging from 70%to 120%.The accuracy of the developed IC-ELISA method was validated by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）.The developed ELISA for dahurica sample showed high correlation with ICP-MS（the correlation coefficients were 0.988）.Thus，it was demonstrated that the established immunoassay for the detection of Hg（II） was reliable.

Key words：mercury；ELISA；polyclonal antibody

汞是自然界存在的在常溫下唯一呈液態(tài)的金屬元素，廣泛的應(yīng)用于生產(chǎn)和生活的各個領(lǐng)域。汞同時(shí)也是一種對生物具有很強(qiáng)毒性的金屬元素，會給生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品帶來污染，對人類健康造成危害，比如甲基汞在食物鏈中富集，不僅毒害動物，而且影響人的腎、肺、大腦及免疫系統(tǒng)[1-2]。汞污染在世界的某些地區(qū)已成為大眾健康的公害[3]。因此，對重金屬汞的檢測就顯得尤為重要。目前常用的重金屬檢測方法主要包括紫外分光光度法（UV）[4]、原子熒光光譜（AFS）法[5]、原子吸收光譜（AAS）法[6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法[7]等。這些方法檢測過程必須在集中大型分析儀器的室內(nèi)進(jìn)行，無法用于現(xiàn)場檢測，具有費(fèi)用高、處理量有限、檢測時(shí)間長等缺陷[8]。因此，對于重金屬汞的快速檢測方法的研究一直沒有停止過。國內(nèi)外對重金屬免疫快速檢測方法已經(jīng)有一定的研究成果[9]。然而，對于實(shí)際應(yīng)用報(bào)道不多。本實(shí)驗(yàn)制備了重金屬汞多克隆抗體、建立了免疫檢測方法和復(fù)雜樣品基質(zhì)的前處理方法，并對汞的免疫檢測方法進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

汞、鉛、鎘、銀、銅、鉻、鎂、鎳、錳、鐵單元素標(biāo)準(zhǔn)品 中國科學(xué)計(jì)量研究院；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE） 日本化學(xué)同仁研究所；鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N-（2-羥乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES） 美國Sigma公司；濃硝酸（優(yōu)級純）、高氯酸（優(yōu)級純） 天津市化學(xué)試劑一廠；白芷 天津某大藥房；胡蘿卜、皮皮蝦 天津某超市。

超純水儀 美國MILLIPORE公司；酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；蛋白純化儀 美國BIO-RAD公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS） 美國Agilent公司；分析天平-BL610 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；高壓消解罐 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；96孔酶標(biāo)板 丹麥Nunc公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫原和包被原的制備 取ITCBE 1.5mg溶于500μL的DMSO中，將ITCBE溶液緩慢滴加到0.68mL的1.0mg/mL硝酸汞標(biāo)準(zhǔn)溶中，待全部加入后，用三乙胺將反應(yīng)物pH調(diào)到6.0，常溫反應(yīng)16h后形成ITCBE-Hg螯合物。取10mg KLH溶于pH9.0的HEPES緩沖溶液中，將螯合好的Hg-ITCBE緩慢滴加到蛋白溶液中，室溫反應(yīng)16h。反應(yīng)完全后用20mmol/L的pH7.4的HEPES緩沖溶液進(jìn)行透析，除去多余的小分子即形成KLH-ITCBE-Hg完全抗原。包被原用BSA制備，Hg2+和BSA的偶聯(lián)方法與Hg2+和KLH的偶聯(lián)方法相同。

1.2.2 標(biāo)品的制備 由于Hg2+直接與抗體反應(yīng)可使抗體變性，需要用螯合劑將金屬離子螯合后才能用于檢測[10]。本實(shí)驗(yàn)選用ITCBE作為Hg2+螯合劑。ITCBE和Hg2+螯合方法如下：1mg ITCBE溶于200μL的DMSO中，在磁力攪拌下向其中緩慢滴加455μL的1.0mg/mL的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（ITCBE和Hg2+的物質(zhì)的量比為1∶1），然后用三乙胺調(diào)節(jié)反應(yīng)物的pH至中性，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16h，即形成標(biāo)準(zhǔn)本品ITCBE-Hg螯合物。

1.2.3 抗體的制備和純化 選用月齡3個月，體重1.5kg左右的新西蘭大白兔作為免疫動物。免疫采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫，初次免疫的抗原用等體積弗氏完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫的抗原用等體積弗氏不完全佐劑混合乳化[11]。初次免疫后每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行四次加強(qiáng)免疫。最后一次加強(qiáng)免疫后第10d從兔子股動脈取全血，離心后得到抗血清。采用Protein A-Sepharose 4B作親合層析介質(zhì)純化抗血清[12]，可獲得特異性抗體。

1.2.4 重金屬汞間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

包被原BSA-ITCBE-Hg用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成1μg/mL，包被在96孔酶標(biāo)板上，100μL/孔，4℃孵育過夜。PBST洗板3次，每孔加入200μL封閉液（0.5%脫脂乳粉），室溫放置1h。PBST洗板3次，空白孔中每孔加入100μL的PBS，控制孔中每孔加入50μL的PBS和50μL的抗體，其他每孔加入50μL梯度稀釋的汞螯合物標(biāo)品和50μL的抗體，室溫振蕩孵育1h。PBST洗板3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔，每孔100μL，室溫振蕩孵育30min。PBST洗板3次，加入底物液，每孔100μL，37℃顯色10min。加入終止液，每孔50μL。酶標(biāo)儀讀數(shù)。計(jì)算不同濃度的汞對抗體與包被原的抑制率I（%）：

以抑制率為縱坐標(biāo)，汞標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出靈敏度（IC50）和最低檢出限（IC15）。

1.2.5 重金屬汞抗體特異性的測定 實(shí)驗(yàn)選擇金屬鎘、鉛、鎳、錳、銅、鉻、鐵、銀、鎂離子進(jìn)行交叉反應(yīng)的測定，檢測抗體的特異性。按照建立的汞的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，用ITCBE螯合其他金屬離子（Cd2+、Pb2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Cr2+、Fe2+、Ag+、Mg2+）代替汞標(biāo)品，按照所建立的方法進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出其他金屬離子的IC50值，交叉反應(yīng)率的計(jì)算公式為：

交叉反應(yīng)率（CR，%）=IC50（汞離子）/IC50（其他金屬離子）×100

1.2.6 樣品的處理以及基質(zhì)影響消除 實(shí)驗(yàn)選擇白芷、胡蘿卜和皮皮蝦為基質(zhì)，采用濕法硝化[13]處理基質(zhì)：取一定量白芷、胡蘿卜和皮皮蝦肉干燥至恒重后研磨粉碎，分別準(zhǔn)確稱取1.0g樣品，向其中加入5mL硝酸和1mL高氯酸，浸泡過夜，然后使用高壓消解罐在300℃硝化至澄清，排出多余的酸后，調(diào)節(jié)硝化液pH至6.0，白芷和胡蘿卜用雙蒸水定容到25mL后過0.22μm的水膜可消除基質(zhì)影響，皮皮蝦用雙蒸水定容到30mL后過0.22um的水膜可消除基質(zhì)影響。

1.2.7 樣品添加回收 實(shí)驗(yàn)選擇白芷、胡蘿卜、皮皮蝦為基質(zhì)，按下面的方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。白芷：稱取三份干燥白芷各1.0g，分別添加30、100、350μL的1mg/mL的汞離子，即添加濃度分別為0.03、0.10、0.35mg/g。充分硝化后，調(diào)節(jié)pH到6.0，加入相同物質(zhì)的量的螯合劑ITCBE，反應(yīng)過夜，然后用雙蒸水定容到25mL。按照步驟1.2.4方法進(jìn)行汞間接競爭酶聯(lián)免疫檢測；胡蘿卜的添加檢測方法和白芷相同；皮皮蝦中添加量分別為36、120、420μL的1mg/mL的汞離子，即添加濃度分別為0.036、0.12、0.42mg/g。硝化后用雙蒸水定容到30mL，其他步驟和白芷相同。

1.2.8 方法驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)選用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）對建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。按照步驟1.2.7方法對白芷進(jìn)行添加，用建立的汞間接競爭酶聯(lián)免疫方法和ICP-MS方法進(jìn)行檢測，對IC-ELISA方法與ICP-MS方法檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 重金屬汞抗原、包被原合成

由于Hg2+既沒有免疫原性，也沒有反應(yīng)原性，為了能夠制備針對汞離子的抗體，必須將汞離子與載體蛋白質(zhì)連接，形成完全抗原[14]。汞離子與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)，可使蛋白質(zhì)變性。因此，我們選擇雙功能螯合劑ITCBE作為汞離子和蛋白質(zhì)的連接橋[15]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 重金屬汞間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Competitive indirect ELISA standard curve of mercury

由于抗體不能直接識別Hg2+，因此需要用螯合劑ITCBE螯合形成ITCBE-Hg螯合物才能進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)[16]。方法的檢測限定義為：在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，抑制率為15%時(shí)對應(yīng)的汞標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值，用IC15表示。靈敏度定義為：在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，抑制率在50%時(shí)對應(yīng)的汞標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值，用IC50表示。由圖1可知，建立的汞間接競爭酶聯(lián)免疫方法的檢測限為0.45μg/L，靈敏度為4.1μg/L。

2.3 抗體的特異性

抗體的特異性用交叉反應(yīng)率來衡量，結(jié)果見表1。

表1 汞抗體的交叉反應(yīng)Table 1 Cross-reactivity of mercury antibody

由表1可知，抗體對鎳和銅的交叉反應(yīng)率分別為10.8%和13.5%，與其他金屬均無明顯交叉反應(yīng)，表明抗體的特異性較好。

2.4 樣品的處理

由于樣品中的汞大多數(shù)是以結(jié)合態(tài)存在的，為了檢測樣品中的汞，需要對基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理。目前主要的處理方法為干法灰化和濕法硝化。由于汞是揮發(fā)性元素，不適合用干法硝化[17]，因此采用濕法硝化處理。濕法硝化包括常壓/高壓濕法硝化及常壓/密閉高壓微波硝化。由于密閉高壓濕法硝化處理，具有設(shè)備簡單、損失小、效率高的特點(diǎn)[18]，因此選用該法對樣品進(jìn)行處理。硝化后調(diào)節(jié)硝化液pH至中性，胡蘿卜硝化后用雙蒸水定容到25mL，過0.22μm的水膜，可以消除基質(zhì)影響。皮皮蝦硝化后用雙蒸水定容到30mL過0.22μm的水膜，可以消除基質(zhì)影響，見圖2。

圖2 基質(zhì)影響消除曲線Fig.2 Matrix influence of samples

2.5 回收率

添加不同水平汞離子，進(jìn)行添加回收率測定。結(jié)果見表2。由表2可知，所有樣品的回收率都在70%～120%，說明建立的方法具有很好的準(zhǔn)確性。

在實(shí)際樣品檢測中，由于盲樣中汞的濃度是未知的，因此加入的螯合劑ITCBE的量必須是過量的，盲樣中加入的ITCBE的物質(zhì)的量一般是盲樣中汞殘留限量（國家標(biāo)準(zhǔn)）的5～10倍。

表2 重金屬汞間接競爭ELISA添加回收（n=3）Table2 RecoveryofmercuryfromspikedsamplesbyELISA（n=3）

2.6 相關(guān)性分析

ELISA方法和ICP-MS方法檢測白芷中Hg2+結(jié)果相關(guān)性比較見圖3。兩種方法的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.988。這表明，同一份樣品同時(shí)用兩種檢測方法測得的結(jié)果一致性很高，進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)所建立的汞間接競爭ELISA檢測結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。

圖3 ELISA和ICP-MS檢測結(jié)果相關(guān)性Fig.3 Comparison of ELISA and ICP-MS for determination of mercury

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功制備了抗汞離子的特異性多克隆抗體，并建立了一種快速有效的檢測重金屬汞離子的間接競爭酶聯(lián)免疫（IC-ELISA）方法。樣品經(jīng)硝化和稀釋即可用于檢測，2.5h即可完成樣品全部檢測過程，檢測效率較高，樣品檢測限低，回收率較高，變異性小。本實(shí)驗(yàn)建立的間接競爭ELISA方法不需要大型儀器設(shè)備，與儀器檢測方法相比，具有檢測費(fèi)用更低，可以同時(shí)檢測大量樣品的優(yōu)點(diǎn)。通過與ICP-MS檢測結(jié)果比較，證明該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

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Development of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Hg（II）

FANG Shu-bing，WANG Jun-ping*，WANG Shuo，ZHANG Yan，SHENG Wei，WANG Jin，YANG Yi-jin
（Key Research Institute of Food Safety Strategy and Management，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

TS207.5+1

A

1002-0306（2012）16-0086-04

2011-12-07 *通訊聯(lián)系人

方淑兵（1988-），男，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

“十二五”“863”計(jì)劃課題（2012AA101604）。