HPLC-MS法測定食品中生物堿的研究

秦軍燕，陳 文，夏寅強(qiáng)，瞿德敬，方國臻，王 碩

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

HPLC-MS法測定食品中生物堿的研究

秦軍燕，陳 文，夏寅強(qiáng)，瞿德敬，方國臻，王 碩*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

建立了一種高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS）法同時測定食品中六種生物堿的方法。采用ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm）色譜柱，乙腈（A）和pH5的4mmol/L乙酸銨溶液（B）為流動相，梯度洗脫使所有分析物均達(dá)到基線分離。采用ESI+一級質(zhì)譜掃描模式得到甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿的定性離子，分別為m/z 118.2、104.2、249.5、290.3、395.4和646.4，結(jié)合質(zhì)譜保留時間檢測六種生物堿。結(jié)果表明，采用1.0mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確性好，RSD＜0.59%。該方法應(yīng)用于檢測實(shí)際樣品荒漠肉蓯蓉、山藥、寧夏枸杞，添加回收率分別為81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，說明建立的方法可以快速準(zhǔn)確的檢測實(shí)際樣品中的生物堿成分。

高效液相色譜，電噴霧質(zhì)譜，生物堿，實(shí)際樣品

Abstract：An high-performance liquid chromatographic electrospray ionization mass spectrometry（HPLC-ESIMS） method was developed for the identification of 6 alkaloids in food.A mixture of acetonitrile（A） and pH5 4mmol/L ammonium acetate aqueous solution（B） were used as the mobile phase for the chro-matographic separation on ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm） column in the gradient elution mode.Under positive electrospray ionization mode，the protonated molecular[M+H]+ions for betaine（m/z 118.2），choline（m/z 104.2），matrine（m/z 249.5），atropine（m/z 290.3），brucine（m/z 395.4） and aconitine（m/z 646.4） and retain time were obtained as qualitative analysis.The experiment results indicated that RSD of the precision was less than 0.59%for adding 1.0mg/mL of spike standard.This method was used in the actual sample Herba Cistanche，Rhizoma Dioscoreae，Lycium bar-barum L testing and the average extraction recoveries were in the range of 81.7%～112.9%，80.8%～117.5%，96.9%～119.3%.A simple，rapid and accurate identification of 6 alkaloids was successfully achieved using the method.

Key words：liquid chromatography；electrospray ionization mass spectrometry；alkaloids；actual sample

肉蓯蓉、枸杞和山藥既是名貴的中藥材，又是食療同源的滋補(bǔ)產(chǎn)品，具有抗腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力及維護(hù)心血管健康等功效。根據(jù)報道枸杞、肉蓯蓉和山藥均含有大量活性成分生物堿[1-4]，目前對該成分的檢測方法有比色法[5]、高效液相色譜法[6-8]、液相質(zhì)譜聯(lián)用法[9-11]等。比色法測定過程復(fù)雜，而且需要乙醚等有機(jī)試劑，對人體危害較大。由于甜菜堿和膽堿結(jié)構(gòu)中無共軛體系，高效液相色譜法僅能在低紫外吸收波長條件下測定，條件要求較高，靈敏度不夠理想，或是衍生操作相對繁瑣。目前雖然有采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法測定生物堿成分的研究，但同時測定甜菜堿、膽堿、阿托品、苦參堿、馬錢子堿及烏頭堿六種生物堿的液相質(zhì)譜方法還未見報道。本實(shí)驗(yàn)利用液相質(zhì)譜法建立一種同時測定這六種生物堿的儀器檢測方法，用于原料肉蓯蓉、山藥和枸杞中的生物堿成分測定，方便快速、簡便，為其功效成分分析提供檢測依據(jù)，對合理的利用和開發(fā)食療同源的原材料具有很好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜菜堿、膽堿、阿托品、苦參堿、馬錢子堿、烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司，純度均＞95%；乙腈、甲醇 美國Merck公司產(chǎn)品，色譜純；甲酸、乙酸銨 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，色譜純；氨水 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，分析純；無水乙醇 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司產(chǎn)品，分析純；水 經(jīng)Millipore超純水系統(tǒng)處理過的超純水。

LCQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有自動進(jìn)樣器、電噴霧離子源（ESI）、LCQ離子阱（ion trap）及Xcalibur1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 美國Finnigan公司產(chǎn)品；ZORBAX SB-C8色譜柱（2.1mm×150mm，3.5μm） 美國Agilent；Centrifuge5804R臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Millipore超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司產(chǎn)品；VGT-1730QT超聲波清洗儀 美瑞泰克公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別稱取0.5000g肉蓯蓉粉末、山藥粉和枸杞粉末，各加入10mL 20%乙醇水溶液，55℃超聲輔助提取30min，在25℃下，4500r/min離心分離20min，重復(fù)提取2次，收集濾液，備用。取2.5mL提取液，置于250mL的容量瓶中，50%乙腈水溶液定容。取1mL上述溶液，經(jīng)0.22μm的微孔有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3 測定條件

1.3.1 質(zhì)譜條件 電噴霧（ESI）離子源；毛細(xì)管溫度270℃；電噴霧電壓4.5kV；鞘氣流速9.0L/min；輔助氣流速1.5L/min；掃描方式采用正離子模式下全掃描和SIM掃描方式；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～1000。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C8色譜柱（2.1mm×150mm，3.5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈（A）和pH5 4mmol/L乙酸銨溶液（B）；梯度洗脫：0min，30%A；5min，70%A；10min，90%A；15min，50%A；30min，30%A；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化質(zhì)譜條件

采用1.0mg/mL六種生物堿的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化質(zhì)譜條件，注射泵手動進(jìn)樣。

2.1.1 確立毛細(xì)管溫度 實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了不同的毛細(xì)管溫度，在200～310℃范圍內(nèi)對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描測定，根據(jù)目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度選擇最合適的毛細(xì)管溫度，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，目標(biāo)物的響應(yīng)值增強(qiáng)，當(dāng)超過270℃時，由于溫度過高，目標(biāo)物損失增大，因此選擇毛細(xì)管溫度270℃。

2.1.2 確立毛細(xì)管電壓 通過質(zhì)譜掃描優(yōu)化毛細(xì)管電壓，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度的大小選擇合適的毛細(xì)管電壓，分別設(shè)置從0～60V的電壓，通過全掃描模式檢測混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在從0～30V過程中，隨著電壓的增大，目標(biāo)物傳輸電離效果增強(qiáng)，儀器響應(yīng)逐漸增大，但當(dāng)再增大電壓時，目標(biāo)物傳輸損失增大，信號降低，所以選擇30V為最佳電壓。

2.1.3 確立電噴霧電壓 分別設(shè)置2.0～5.5kV的電壓，根據(jù)離子響應(yīng)強(qiáng)度選擇最合適的電噴霧電壓值，在2.0～4.5kV過程中，噴霧電壓的增大有利于目標(biāo)物更好的充分發(fā)生電離，儀器信號逐漸增強(qiáng)，但過高的噴霧電壓能夠造成目標(biāo)離子傳輸過程中的損失增大，所以選擇4.5kV為最佳電壓。

2.1.4 選定定性離子 根據(jù)以上優(yōu)化條件，采用正離子掃描檢測模式，ESI電離源條件下堿性化合物很容易加合質(zhì)子，形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+和[2M+H]+，也會形成少量金屬離子綴合物的[M+Na]+和[2M+Na]+形式，這些準(zhǔn)分子離子峰的信息對應(yīng)于生物堿化合物的分子量信息，為所測定樣品是否是目標(biāo)成分提供科學(xué)判據(jù)。在上述質(zhì)譜條件下，甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿的質(zhì)譜圖見圖1，分別選定m/z是118.2、104.2、249.5、290.3、395.4和646.4的準(zhǔn)分子離子峰作為甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿的定性離子。

圖1 甜菜堿（a）、膽堿（b）、苦參堿（c）、阿托品（d）、馬錢子堿（e）和烏頭堿（f）標(biāo)準(zhǔn)品在正離子模式下的質(zhì)譜圖Fig.1 Qualitative ion information of six alkaloids standard under positive ion mode

2.2 液相條件的確定

2.2.1 選擇色譜柱 根據(jù)報道常采用C18和C8系列色譜柱，本實(shí)驗(yàn)選擇Hypersil GOLD C18（2.1mm×100mm；Thermo）；ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent）；ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×150mm，5.0μm；Agilent）和ZORBAX Eclipse Pluse C18（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent）四種色譜柱；經(jīng)過優(yōu)化，采用色譜柱ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent），可以達(dá)到基線分離且具有對稱的峰形。

2.2.2 優(yōu)化流動相梯度 采用梯度洗脫，通過不同梯度優(yōu)化，在如下梯度洗脫時目標(biāo)物得到較好的基線分離和峰型，因此選擇梯度：0min，30%乙腈70%水相；5min，70%乙腈30%水相；10min，90%乙腈10%水相；15min，50%乙腈50%水相；30min，30%乙腈70%水相。

2.2.3 優(yōu)化流動相鹽溶液濃度 流動相中加入緩沖鹽可以增加目標(biāo)離子的電離效果，提高其儀器響應(yīng)信號，根據(jù)儀器自身的條件，選擇易揮發(fā)性的乙酸銨溶液作為流動相。分別配制濃度為0、2、4、5、6、8、10mmol/L的乙酸銨溶液，采用優(yōu)化的質(zhì)譜條件，結(jié)果如圖2所示，在4mmol/L六種生物堿的儀器響應(yīng)已經(jīng)相對達(dá)到最大，考慮緩沖鹽對質(zhì)譜儀器的影響，最終選擇乙酸銨濃度為4mmol/L。

圖2 乙酸銨濃度對生物堿類物質(zhì)峰面積的影響Fig.2 The effect on peak area of alkaloids about the ammonium acetate concentration

2.2.4 優(yōu)化乙酸銨溶液的pH 流動相中通過添加酸調(diào)節(jié)pH可以提高電離效率，增加目標(biāo)物的響應(yīng)值，同時會影響各個物質(zhì)的響應(yīng)峰面積及保留時間，采用甲酸調(diào)節(jié)了一系列不同的乙酸銨溶液pH，分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，經(jīng)過液相色譜質(zhì)譜檢測，如圖3所示，當(dāng)pH從3.0逐漸增大時，酸對生物堿類目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)破壞降低，儀器檢測響應(yīng)逐漸增大，但在pH達(dá)到5.0之后，隨著酸度降低，不利于加合質(zhì)子，形成準(zhǔn)分子離子峰，造成響應(yīng)降低，所以，最終選擇乙酸銨溶液的pH為5.0。

圖3 流動相pH對生物堿類物質(zhì)峰面積的影響Fig.3 The effect on peak area of alkaloids about the mobile phase pH

2.2.5 優(yōu)化色譜柱柱溫 在25～40℃范圍內(nèi)分別設(shè)置20、25、30、35、40℃五個溫度水平，結(jié)果表明，柱溫對生物堿成分的峰面積影響不大，考慮色譜柱使用壽命問題，選擇柱溫30℃。

按照優(yōu)化好的液相色譜條件，得到六種生物堿的分離質(zhì)譜圖，1～6號峰依次分別為甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿，如圖4所示。

圖4 六種標(biāo)準(zhǔn)品高效液相質(zhì)譜圖Fig.4 The HPLC-MS of the six standard materials

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取1.0mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述液相質(zhì)譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，其六種生物堿標(biāo)品的相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于0.59%，表明儀器精密度良好。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

平行配制6份1.0mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定，結(jié)果六種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品的相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于1.19%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 實(shí)際樣品驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)測定了荒漠肉蓯蓉、寧夏枸杞和山藥三種實(shí)際樣品，在荒漠肉蓯蓉和寧夏枸杞的提取液中，圖5（a）、（b）中1號峰的保留時間和質(zhì)譜信息與甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品的信息匹配，定性為甜菜堿，其余峰為雜質(zhì)峰，同時根據(jù)液相質(zhì)譜信息證明，兩者不含有膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿。在山藥提取液中，圖5（c）中1號峰經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間和質(zhì)譜信息對照為膽堿，不含其他五種生物堿成分。

圖5 （a）肉蓯蓉樣品、（b）寧夏枸杞樣品、（c）山藥樣品的HPLC-MS圖譜Fig.5 The HPLC-MS of alkloid components in sample Herba Cistanche（a），Lycium barbarum（b），Rhizoma Dioscoreae（c）

分別在三種實(shí)際樣品中添加1.0mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2樣品前處理方法，平行測定三次，添加回收率分別為81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，RSD分別小于8.34%、10.03%、9.77%。

3 結(jié)論

建立一種快速準(zhǔn)確的HPLC-ESI-MS法同時識別藥食同源材料中生物堿成分，利用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化質(zhì)譜條件和色譜條件，方法精密度、重現(xiàn)性的RSD值分別小于0.59%、1.19%，將該方法用于實(shí)際樣品檢測，添加回收率分別為81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，結(jié)果證明，建立的方法適合于實(shí)際樣品中的生物堿成分識別。

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Study on determination of alkaloids in food by high performance liquid chromatography mass spectrometry

QIN Jun-yan，CHEN Wen，XIA Yin-qiang，QU De-jing，F(xiàn)ANG Guo-zhen，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering&Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0073-04

2012-01-13 *通訊聯(lián)系人

秦軍燕（1986-），女，研究生，研究方向：食品安全檢測。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAK17B03）。