豬圓環(huán)病毒2型Rep蛋白ELISA抗體檢測方法的建立

李 杰，葛 猛，羅 維，舒曉亮，蔣大良，李潤成，李 波，劉國華，余興龍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.懷化市動物防疫監(jiān)督站，湖南懷化418000)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是 Tischer等于1974年在PK-15細胞中發(fā)現(xiàn)，被認為是豬腎細胞PK-15的污染物，而且是非致病性的病毒。該病毒無囊膜，基因組由一條單股圓環(huán)狀的DNA鏈組成。1991年，加拿大學(xué)者首次提出斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)與 2型PCV(PCV2)有關(guān)[1]。目前國內(nèi)外對PCV2疫苗進行了廣泛研究，但疫苗免疫和自然感染的豬均會產(chǎn)生Cap蛋白抗體，目前的檢測方法無法區(qū)分這兩種抗體。

PCV2的Rep蛋白(Rep2)為病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，只有病毒在動物體內(nèi)增殖時才存在并刺激機體產(chǎn)生抗Rep蛋白抗體，因此利用Rep蛋白建立特異性間接ELISA方法，不僅可以作為PCV2血清抗體檢測的新方法，還可以區(qū)分自然感染和疫苗免疫。目前國內(nèi)暫無以Rep蛋白為包被抗原的ELISA方法；國外Eva Prez-Martn等用桿狀病毒系統(tǒng)表達出PCV2的Rep蛋白并建立以其為包被抗原的ELISA方法，并與Cap2-ELISA方法結(jié)合使用對PCV2進行大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查[2]。本實驗將PCV2-Rep在E.coli中表達，以純化重組Rep2蛋白作為檢測抗原建立間接ELISA方法，用于血清中PCV2Rep蛋白抗體的檢測。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 pET-28a(+)載體購自Novagen公司；E.coli感受態(tài)細胞DH5α和BL21(DE3)均由本實驗室制備并保存；選擇經(jīng)韓國檢測試劑盒和IFA法檢測PCV2抗體均為陰性或陽性的血清作為陰陽性血清；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和口蹄疫病毒(FMDV)等標準陽性血清均來自檢測試劑盒。

1.2 主要試劑 PFU DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs和IPTG購自北京鼎國生物公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和蛋白質(zhì)分子量標準(低)購自TaKaRa公司；DL5000DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA瓊脂凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技公司；High-Affinity Ni-IDA Resin購自Novagen公司；蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司；96孔ELISA板購自美國Costa公司；辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG(HRP-IgG)購自Sigma公司；TMB底物購自美國KPL公司；韓國進口檢測試劑盒購自韓國金諾公司；SB封閉液購自Thermo公司。

1.3 目的蛋白的表達與純化 利用Lasergene Meg Align軟件分析，參照GenBank登錄序列(AY188355)由金思特科技(南京)有限公司人工合成PCV2-Rep，根據(jù)E.coli稀有密碼子對序列進行優(yōu)化，同時在序列兩端分別加入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點。

采用EcoRⅠ和SalⅠ分別對PCV2-Rep和pET-28a(+)進行雙酶切?；厥漳康钠尾⒁訲4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，37℃培養(yǎng)過夜，采用帶Kan抗性的LB瓊脂平板篩選，挑取單個菌落采用PCR和酶切鑒定陽性克隆，由北京華大基因研究中心進行測序。將構(gòu)建的pET-Rep2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)中，37℃ M 9ZB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達3h，SDS-PAGE鑒定。

純化目的蛋白，SDS-PAGE檢測其純度。回收純化的蛋白樣品測定蛋白濃度。

1.4 重組蛋白western blot分析 分別取誘導(dǎo)的全菌、上清液和沉淀與未誘導(dǎo)的全菌進行SDS-PAGE電泳，并進行western blot檢測，增強型HRP-DAB底物顯色試劑進行顯色。

1.5 PCV2-Rep間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化 將純化的重組Rep2蛋白抗原以碳酸鹽緩沖液分別作0.5μg/m L～16μg/m L 2倍倍比稀釋，4℃包被24h。以5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。以封閉液對 PCV2陰陽性血清分別進行 1∶25、1∶50、1∶100和1∶200倍稀釋，組成方陣，37℃作用1h，酶標二抗(1∶20000)37℃作用30min，底物避光顯色10min，終止反應(yīng)，在酶聯(lián)檢測儀上讀取OD450nm值，每個樣品平行做2孔，取平均值(下同)。選擇陽性血清的OD450nm值為1左右并且陰性血清OD450nm值較低的抗原濃度和血清稀釋倍數(shù)，作為抗原最適包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。通過最佳封閉液、血清稀釋液、血清作用時間、酶標二抗和底物作用時間的篩選，建立ELISA標準化程序。

1.6 陰陽性血清臨界值的確定 選擇經(jīng)鑒定為陽性的血清，以建立的ELISA法進行檢測，選擇OD450nm值在1.0左右的血清作為參考陽性血清；相同方法選擇OD450nm值為0.1左右的血清為參考陰性血清。本實驗采用S/P值判定檢測結(jié)果。用建立的ELISA方法檢測30份已確定的陰性血清樣品，取陰性血清平均OD450nm值+3×標準差為陽性臨界值，樣品OD450nm值/參考陽性血清OD450nm值為樣品S/P值，陽性臨界值/參考陽性血清OD450nm值為臨界S/P值。

1.7 重復(fù)性、特異性和敏感性試驗 在同樣條件下，用同一批包被的酶標反應(yīng)板，對8份被檢血清重復(fù)檢測4次，判定其批內(nèi)重復(fù)性；用4個不同批次包被的反應(yīng)板，對8份血清進行重復(fù)檢測，判定其批間重復(fù)性。用建立的Rep2ELISA方法檢測PRRSV、CSFV、PRV和FMDV標準陽性血清，進行交叉反應(yīng)試驗。將PCV2陽性血清平行倍比稀釋進行ELISA方法的敏感性試驗。

1.8 與韓國金諾公司PCV2診斷試劑盒的對比試驗采用建立的Rep2ELISA方法與韓國金諾公司的PCV2診斷試劑盒同時檢測118份血清，進行比較。

1.9與PCV2-Cap間接ELISA方法的對比試驗采用建立的Rep2ELISA方法檢測由本實驗室保存的816份血清樣品。并與本實驗室已經(jīng)建立的Cap2-ELISA方法進行比較。

2 結(jié)果

2.1 PCV2-Rep蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及western blot鑒定 以pET-Rep2為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在約1000bp處出現(xiàn)一條特異性片段(圖1)，與目的片段相符。將誘導(dǎo)表達產(chǎn)物采用SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果顯示，目的蛋白與預(yù)期相符，分子量約為40ku(圖2a)。純化蛋白的純度在95%以上，Rep2蛋白濃度為0.248mg/m L(圖2)。Western blot結(jié)果顯示PCV2-Rep蛋白誘導(dǎo)表達組在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶(圖2b)。表明重組Rep2蛋白能夠與特異性血清反應(yīng)。

2.2 間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化 采用方陣滴定法測定和條件優(yōu)化，最終確定抗原包被量為200ng/孔，血清稀釋倍數(shù)為50倍，封閉液和血清稀釋液均為5%脫脂奶粉，血清酶標二抗作用時間分別為45m in和30min，底物顯色時間為10min，血清臨界S/P值為0.3。

2.3 特異性試驗結(jié)果 采用已經(jīng)建立的Rep2ELISA方法檢測PRRSV、CSFV、PRV和FMD標準陽性血清，S/P值均低于0.3，為陰性，表明本研究建立的方法特異性良好。

圖1 重組質(zhì)粒pET-Rep2的PCR擴增Fig.1The PCR identification of pET-Rep2recombinant plasm id

圖2 重組Rep2蛋白的SDS-PAGE和western blot鑒定Fig.2Analysis of recombinant Rep2protein by SDA-PAGE and western blot

2.4 敏感性試驗結(jié)果 按照最佳反應(yīng)參數(shù)，將陽性血清稀釋至1∶800進行ELISA試驗，S/P值依然大于0.3，表明該方法敏感性較好。同時也表明本實驗使用的陽性血清效價滴度為1∶800。

2.5 重復(fù)性試驗 對8份血清4次重復(fù)檢測，批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，陽性血清檢測孔OD450nm值變異系數(shù)均小于10%(表1)。

表1 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 1Repeatability of ELISA test

2.6 與PCV2診斷試劑盒的對比試驗結(jié)果 采用建立的方法對118份豬血清樣品進行檢測，陽性率為72.9%(86/118)，并與韓國金諾試劑盒檢測結(jié)果比較，符合率為81.4%(表2)。

2.7 與PCV2-Cap間接ELISA方法的對比試驗結(jié)果 將Rep2ELISA方法與本實驗室建立的Cap2-ELISA方法檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示本研究建立的方法檢測陽性率較低(表3)。

表2 與韓國試劑盒檢測比較結(jié)果Table 2Comparison w ith South Korea Jinnuo Kit on 118clinical serum samples

表3 兩種ELISA方法對臨床血清樣品PCV2抗體的檢測結(jié)果Table 3PCV2antibodies of clinical serum sample test results by two ELISA method

3 討 論

Western blot分析表明本實驗得到的重組蛋白可以與特異性陽性血清反應(yīng)，這與張停婷等實驗結(jié)果一致[3]，因此以在E.coli中原核表達獲取的重組蛋白Rep2可以作為一種候選抗原蛋白建立間接ELISA方法檢測豬群中PCV2的抗體。

PCV抗體檢測時常用方法有ELISA、免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)、免疫熒光法、IPMA和膠體金免疫層析法等，而ELISA以其操作簡單、敏感性高、快速、易標準化等優(yōu)點，常用于大規(guī)模血清學(xué)檢測[1,4-5]。PCV2的Rep蛋白是病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，但PCV2感染動物后均能夠產(chǎn)生抗Rep2抗體[6]，因此，Eva等用桿狀病毒系統(tǒng)表達的PCV2Rep蛋白建立了ELISA方法[2]，并與Cap2-ELISA方法結(jié)合使用，對107份臨床樣品進行了檢測，表明該方法適合對PCV2和PMWS進行大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查。本研究建立的方法與韓國金諾試劑盒比較，特異性較低，而那幾份特異性有差異的血清均為4周齡～7周齡的小豬血清，這可能與斷奶仔豬中抗Rep和Cap抗體消失的快慢有關(guān)。兩者符合率為81.4%，表明該方法具有較好的臨床應(yīng)用價值，可以用于豬群PCV2-Rep蛋白抗體的檢測。

Puvanendiran等對美國育肥豬的PCV流行情況做了調(diào)查，結(jié)果顯示大部分豬PCV1血清陰性，而PCV2陽性率較高，達到80%[7]。李欣等用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)PCV2ELISA檢測試劑盒檢測南陽市屠宰場360份血清，陽性率為66.3%[8]。本實驗同時用兩種ELISA方法檢測PCV2抗體，Rep2-ELISA方法檢測陽性率為71.9%，而Cap2-ELISA方法檢測陽性率為81.9%，陽性率和國內(nèi)外檢測結(jié)果基本相符，Cap2-ELISA方法的敏感性高于Rep2-ELISA方法，這可能與Cap蛋白是PCV2病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白并具有較高的免疫原性有關(guān)。

本研究通過原核表達和Ni2+親和層析方法純化獲得重組Rep2蛋白，通過梯度滴定包被和條件優(yōu)化，建立了檢測PCV2抗體的間接ELISA方法，其具有較高特異性和敏感性，適用于PCV2的流行病學(xué)調(diào)查和防制工作。

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