SSR標記在家蠶×野桑蠶后代群體分析中的應用

彭云武，楚 渠

(安康學院，陜西 安康 725000)

野桑蠶 (Bombyx mandarina)是一種與家蠶親緣關(guān)系最近的野生資源，蘊含著豐富的遺傳信息，是家蠶品種選育的寶貴材料［1］。1999年后，SSR分子標記在家蠶資源的遺傳多樣性分析、基因作圖、基因定位、品種鑒定和標記輔助育種等方面進行了應用［2－6］。在農(nóng)作物方面，鐘昌松等［7］用 SSR標記對普通玉米和特用玉米進行聚類分析，王海燕等［8］利用SSR標記分析云南、西藏和新疆小麥的遺傳多樣性，王凱華等［9］用 SSR標記分析甘藍型油菜種質(zhì)遺傳多樣性，邱紅波等［10］用SSR標記對貴州玉米種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，宗緒曉等［11］利用SSR標記分析中國豌豆地方品種遺傳多樣性，吳曉雷等［12］用SSR標記研究大豆屬種間親緣進化關(guān)系，張真真等［13］對矮化佛手的遺傳差異進行SSR分析。作者用SSR標記對家蠶 ×野桑蠶后代群體進行親緣關(guān)系與遺傳多態(tài)性的研究，為野桑蠶資源利用和家蠶雜交育種親本的選配及雜種后代的預選提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的26份材料 (表1)中有家蠶品種2個，分別是874和873;野桑蠶品種4個，分別是CS6、Bh1、Bh2、Tb2;栗蠶材料1個;其余的為家蠶×野桑蠶的品種組合。采用在公開期刊上發(fā)表的應用于家蠶的SSR引物序列［14］(表2－3)，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。TaqDNA聚合酶和dNTP購自北京鼎國生物公司。

表1 供試材料的類型及來源

表2 SSR(Chr 1－15)引物的名稱、序列及大小

表3 SSR(Chr 16－28)引物的名稱、序列及大小

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法進行提取。在65℃水浴鍋中預熱CTAB提取液;每供試材料取雙翅在液氮中迅速研磨，將粉末狀材料轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入預熱的CTAB提取液 (每克樣品加入3～5 mL的提取液)，65℃保溫30～60 min，每隔10 min輕輕顛倒混勻;12 000 r·min－1離心5 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管;加入等體積酚/氯仿 (1∶1)，充分混勻，12 500 r·min－1離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管;加入等體積氯仿，充分混勻，12 500 r·min－1離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管;重復加入酚/氯仿和氯仿的步驟;加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15 min;12 000 r·min－1離心6 min，棄上清;將沉淀用70%的乙醇漂洗1次，室溫下12 500 r·min－1離心 2 min，棄上清，重復洗1次;提取產(chǎn)物取2～3 μL用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物檢測及退火

以1號樣本為模板，分別選擇 45.8，49.1，53.7，62.5和65℃作為退火溫度，根據(jù)檢測結(jié)果和經(jīng)驗給出建議退火溫度，并從100對SSR引物中篩選出能夠有效擴增的引物為初篩合格引物。再選取其中擴增效果好、條帶差異明顯、重復性好、信號強、背景清晰的引物在26份不同類型材料間進行SSR-sPCR反應。

1.3 PCR反應和電泳

PCR反應在PCR儀上進行，反應體系為20 μL，其中 ddH2O 7.2 μL，2 × PCRMix 10 μL，正向引物 0.3 μL，反向引物 0.3 μL，DNA 2 μL，Taq酶 0.2 μL PCR擴增程序:94℃ 4 min→ (94℃35 s;62.5℃35 s;72℃50 s)×35個循環(huán)→72℃10 min→4℃后取出擴增產(chǎn)物。反應完成后每個反應體系中加入10 μL裝載染料。電泳緩沖液為1×TBE，電流50 mA，電泳時間為75 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每一對SSR引物電泳后將在特定位置出現(xiàn)擴增帶，將凝膠成像系統(tǒng)中成像圖片掃描并數(shù)擴增帶數(shù)。同一標記在不同材料中擴增出來的條帶，在某一位置有帶存在記為1，沒有的則記為0。用浙江大學開發(fā)的DPS v7.05版統(tǒng)計軟件中的子程序多元分析，選聚類分析，再選0，1數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類，聚類距離選Nei-Li(Czekanoeki);聚類方法選類平均法 (UPGMA)，得出遺傳距離和聚類樹形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

以1號樣本為模板，引物檢測的結(jié)果是擴增好的81對，擴增不太好的11對，沒有擴增的8對。經(jīng)瓊脂糖檢測獲得69對擴增比較好的引物進行PAGE檢測 (圖1)。

圖1 引物的PAGE檢測結(jié)果

2.2 DNA的多態(tài)性分析

采用69對引物對表1所列品種的基因組DNA進行擴增，共獲得2 529個多態(tài)性片段，平均每對引物擴增出等位片段36.6個 (圖2)。等位片段數(shù)最多的為S0105，共有113個，等位片段數(shù)最少的為S1706和 S2707，均為21個。各品種的擴增帶從23～115條不等。由此可見不同引物、不同品種之間的多態(tài)性各不相同。

圖2 引物S2215的擴增情況

2.3 親緣關(guān)系的聚類分析

用69對引物對26個材料的DNA進行PCR擴增，將各引物的擴增結(jié)果轉(zhuǎn)化為0，1數(shù)據(jù)，利用浙江大學的DPS v7.05版統(tǒng)計軟件中的Nei-Li(Czekanoeki)方法計算各品種間的遺傳距離，并進行聚類分析，得到如圖3所示的樹狀。

圖3 家蠶、野桑蠶及其它們雜交后代SSR分析的遺傳關(guān)系

研究結(jié)果顯示，26個材料中最先聚在一起的是Ak11051(野蠶斑)和Ak11051(普斑)，即幼蟲斑紋不同的同一品種，說明所選SSR標記引物足以區(qū)分親緣關(guān)系很近的不同材料。26個試驗材料之間的遺傳距離最小的為0.110 9，最大為1.918 3，表明供試材料具有豐富的遺傳多樣性。

根據(jù)SSR分子標記聚類分析可知，供試的26個材料分為明顯的4個大類群:第1大類群為栗蠶;第2大類群有Bh1和CS6野桑蠶材料;第3大類群Tb1和Tb2野桑蠶材料，表明同一區(qū)域內(nèi)的野桑蠶的親緣關(guān)系較近;第4大類群又按品種間親緣關(guān)系的遠近分為2大亞類，即與家蠶873遺傳性狀相近的聚為1個亞類、與家蠶874遺傳性狀相近的聚為另1個亞類。

3 小結(jié)與討論

雜交育種是選育新品種的主要途徑，也是近代家蠶育種工作的重要方法。本研究所用材料是家蠶×野桑蠶雜交所得的后代群體，變異類型豐富，為培育家蠶新品種提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究選用了69對家蠶SSR引物對26種供試材料基因組DNA進行了擴增。聚類結(jié)果表明，SSR標記可以完全鑒別出本試驗中的家蠶的兩大系統(tǒng)，這與郭秋紅等［15－16］用 SSR標記對家蠶品種進行親緣關(guān)系分析得到的結(jié)果基本一致。

白河野桑蠶與漢濱野桑蠶各聚一類，試驗結(jié)果印證了白河野桑蠶是一個與其他野桑蠶材料遺傳差異大的野桑蠶［17］。所以，微衛(wèi)星標記能較為客觀地反映不同地方野桑蠶的遺傳關(guān)系。

［1］向仲懷．中國蠶種學 ［M］．成都:四川科學技術(shù)出版社，1995．

［2］李競，房守敏，劉文明，等．SSR標記在中國野桑蠶和家蠶的遺傳多樣性分析中的應用 ［J］．蠶業(yè)科學，2005，31(3):251－256．

［3］Li M W，Shen L，Xu A Y，et al．Genetic diversity among the silkworm(Bombyx moriL．，Lep．，Bombycidae)germplasm revealed by microsatellites ［J］．Genome，2005，48:802－810．

［4］侯成香，李木旺，張月華，等．利用SSR標記進行家蠶部分品種資源的指紋圖譜分析 ［J］．中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39(10):2124－2131．

［5］房守敏．基于 SSR-GeneScan技術(shù)的家蠶起源與進化研究［D］．西南農(nóng)業(yè)大學，2005．

［6］沈利，李木旺，李明輝，等．家蠶微衛(wèi)星標記的篩選及其在遺傳多樣性分析中的應用 ［J］．蠶業(yè)科學，2004，30(3):230－236．

［7］鐘昌松，徐利遠，余桂蓉，等．普通玉米和特用玉米的SSR標記聚類 ［J］．核農(nóng)學報，2009，23(1):42－48，74．

［8］王海燕，王秀娥，陳佩度，等．利用SSR標記分析云南、西藏和新疆小麥的遺傳多樣性 ［J］．遺傳學報，2007，34(7):623－633．

［9］王凱華，張文英，王會，等．國內(nèi)外甘藍型油菜種質(zhì)SSR標記遺傳多樣性分析 ［J］．中國農(nóng)學通報，2011，27(19):144－149．

［10］邱紅波，戴保威，彭中華．利用SSR標記對貴州玉米種質(zhì)進行遺傳多樣性分析 ［J］．浙江農(nóng)業(yè)學報，2011，23(4):667－670．

［11］宗緒曉，關(guān)建平，王述民，等．中國豌豆地方品種SSR標記遺傳多樣性分析 ［J］．作物學報，2008，34(8):1330－1338．

［12］吳曉雷，賀超英，陳受宜，等．用SSR分子標記研究大豆屬種間親緣進化關(guān)系 ［J］．遺傳學報，2001，28(4):359－366．

［13］張真真，王俊軍，郭衛(wèi)東．矮化佛手遺傳差異的SSR分析［J］．浙江農(nóng)業(yè)科學，2009(1):67－71．

［14］Miao Xuexia，Xu Shijie，Li Minghu，et al．Simple sequence repeat-based consensuslinkagemap ofBombyxmori［J］．PNAS November 8，2005，102(45):16303－16308．

［15］郭秋紅，李木旺，李明輝，等．利用SSR標記鑒定家蠶不同系統(tǒng)的品種初探 ［J］．蠶業(yè)科學，2005，31(3):257－260．

［16］錢荷英，李木旺，張月華，等．用SSR標記進行家蠶日系品種資源指紋圖譜的構(gòu)建及親緣關(guān)系分析 ［J］．蠶業(yè)科學，2005，31(4):422－428．

［17］彭云武，楚渠，楊金宏，等．安康野桑蠶遺傳多樣性分析［J］．西北農(nóng)業(yè)學報，2010，19(11):24－28．