用最小距離逐步取樣法構(gòu)建野核桃核心種質(zhì)

袁海濤，董玉芝，王肇延

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

種質(zhì)資源是品種選育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此其搜集和保護(hù)越來越受到各國研究學(xué)者所重視。隨著世界各國種質(zhì)資源庫數(shù)量的不斷增加，種質(zhì)資源規(guī)模過大而難以管理和利用這一難題便出現(xiàn)于研究者面前。為了解決這一難題，F(xiàn)rankel［1］于1984年首次提出了核心種質(zhì) (core collection)的概念，之后，F(xiàn)rankel與 Brown［2－3］又進(jìn)一步地發(fā)展了核心種質(zhì)這一概念，核心種質(zhì)即采用一定的方法，從整個種質(zhì)資源中選擇一部分樣本，以最小的資源數(shù)量和遺傳重復(fù)最大程度地代表整個種質(zhì)資源的多樣性，從而方便于種質(zhì)的保存、評價和利用，但核心種質(zhì)以外的資源材料并不被遺棄，而作為保留種質(zhì)保存。

新疆野核桃 (Juglans regia)在我國僅分布于新疆伊犁哈薩克自治州鞏留縣野核桃溝自然保護(hù)區(qū)，主要保護(hù)對象是第3紀(jì)溫帶落葉闊葉林的殘遺植物——野核桃及其生境。這片野核桃林是世界稀有、亞洲唯一的野核桃林，經(jīng)考證，該林中生長的野核桃是栽培核桃的直接祖先［4－5］。野核桃林中蘊(yùn)含了野核桃大量優(yōu)良性狀的基因，擁有十分豐富的種質(zhì)資源，儲備著我國重要的核桃資源，是研究栽培核桃起源、進(jìn)化、自然選擇不可多得的原始材料。

從野生核桃的研究文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，在2006年以前，學(xué)者們對新疆野生核桃林的研究基本局限于生存環(huán)境、形態(tài)分類、生物學(xué)等方面［6－11］，2007年劉曉麗［12］首次利用分子系統(tǒng)學(xué)的原理采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對新疆伊犁野核桃、喀什實(shí)生核桃及部分栽培品種的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明伊犁野生核桃的遺傳多樣性最低。2010年王肇延采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對新疆伊犁鞏留縣野核桃進(jìn)行了遺傳多樣性分析［13］。但野核桃核心種質(zhì)構(gòu)建方面系統(tǒng)深入的研究卻未見報道。本文利用新疆伊犁鞏留縣野核桃SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，運(yùn)用最小距離逐步取樣法構(gòu)建野核桃核心種質(zhì)，以求為野核桃今后的保護(hù)、育種和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

采集新疆野核桃溝的野核桃葉片4 457份，占野核桃溝內(nèi)野核桃總數(shù)的95.93% (地徑大于10 cm的)。

1.2 分子標(biāo)記

采用SSR分子標(biāo)記方法，用篩選出的13對引物對4 457份試材進(jìn)行標(biāo)記。

將SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果數(shù)值化，在相同的遷移率位置上，雜合帶記為1、上帶記為2、下帶記為3、對于譜帶模糊不清或由其他原因造成的數(shù)據(jù)缺失記為9。將數(shù)值統(tǒng)計結(jié)果錄入計算機(jī)，建立多元數(shù)據(jù)矩陣。本文作者和王肇延［13］共同完成了采樣、提取DNA、引物篩選、SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)的整理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建方法

根據(jù)SSR標(biāo)記得到的數(shù)據(jù)，利用SPSS18.0軟件用歐氏距離 (euclidean distance)來衡量，采用Ward's法進(jìn)行聚類分析。

1.3.1 總體取樣比例

根據(jù)國內(nèi)外關(guān)于核心種質(zhì)的研究結(jié)果，核心種質(zhì)的規(guī)模一般占原始群體的30%～5%，考慮到新疆野核桃群體內(nèi)遺傳變異小的特點(diǎn)，故選取占原始群體樣品30%～1%比例范圍的樣品作為核心樣本集。

1.3.2 取樣方法

根據(jù)聚類結(jié)果用最小距離逐步取樣法 (least distance stepwise sampling strategy， LDSS)［14－15］:找出遺傳距離最小的一個組，隨機(jī)刪除該組2樣品之一，另一個樣品被保留。若組中包含2份以上的樣品，則只隨機(jī)保留一個進(jìn)入下一輪聚類，其余樣品去除。

1.4 核數(shù)據(jù)分析

根據(jù)相關(guān)遺傳參數(shù)的公式，在Excel 2007中計算出各個核心樣本集的Nei's遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)，并用SPSS18.0對得到的 Nei's遺傳多樣性指數(shù) (Nei's gene diversity，H)和Shannon信息指數(shù) (Shannon's Information index，I)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

本文采用平均Nei's基因多樣性指數(shù)和平均Shannon信息指數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

其中，Ρi為種群中第i個等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)目。

2 結(jié)果和分析

2.1 核心種質(zhì)的選擇

根據(jù)各個核心樣本集遺傳多樣性保留率的比較，同時在最大限度保留原始種質(zhì)遺傳變異的原則上，選取431份樣本作為核心種質(zhì)，其平均Shannon信息指數(shù)保留率和平均 Nei's基因多樣性指數(shù)保留率均達(dá)100%。

2.2 核心種質(zhì)與初始種質(zhì)的比較

從表1中可以看出核心種質(zhì)的Shannon信息指數(shù)保留率和Nei's基因多樣性指數(shù)保留率均達(dá)到百分之百，說明核心種質(zhì)群體在基本保持其初始群體遺傳結(jié)構(gòu)的同時，其遺傳差異性較初始種質(zhì)群體要大，遺傳多樣性較初始種質(zhì)群體豐富。

從表2可以看出核心種質(zhì)Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)在概率0.05水平上不顯著，表明核心種質(zhì)能較好地代表初始種質(zhì)。

表1 核心種質(zhì)與初始種質(zhì)多樣性指數(shù)的比較

表2 核心種質(zhì)與初始種質(zhì)t檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 保留種質(zhì)與核心種質(zhì)的比較

從表3可以看出，比較Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)，核心種質(zhì)均大于保留種質(zhì)。從表4中可以看出，核心種質(zhì)的Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)在在95%置信區(qū)間上與保留種質(zhì)差異不顯著。但核心種質(zhì)的Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)均大于保留種質(zhì)，可以優(yōu)先選用。

表3 保留種質(zhì)與核心種質(zhì)遺傳多樣性的比較

2.4 微型核心種質(zhì)

種質(zhì)資源量過大，會給資源的保存、評價、鑒定和利用帶來諸多困難，鑒于此，有的學(xué)者提出了微型核心種質(zhì) (mini core collection)的概念，即將核心種質(zhì)的規(guī)模進(jìn)一步壓縮，僅用1%的樣本數(shù)代表整個種質(zhì)資源群體的遺傳多樣性［15］。

本研究所選取的核心種質(zhì)樣本量為431份，樣本量略大，在實(shí)際的保護(hù)和利用方面可能會存在問題?；诖耍狙芯苛磉x取所構(gòu)建的核心子集中49份樣本作為微型核心種質(zhì)，其Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)的保留率分別達(dá)到了98.32%和98.77%，說明微型核心種質(zhì)可以代表初始種質(zhì)的遺傳多樣性。

表4 保留種質(zhì)與核心種質(zhì)的Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)和討論

2008年鞏留縣野核桃自然保護(hù)區(qū)被批準(zhǔn)為4A級旅游景區(qū)后，越來越多的游人到野核桃溝參觀游覽，這同時對保護(hù)珍貴的物種形成了嚴(yán)重威脅。因此，構(gòu)建野核桃核心種質(zhì)對野核桃種質(zhì)資源進(jìn)行有效地保護(hù)和利用意義重大。

通常情況下，核心種質(zhì)的總體取樣比例30%～10%，但對于無性繁殖的野核桃來說，其生存環(huán)境相對封閉，遺傳變異均發(fā)生在種內(nèi)，極少的樣本可能就會代表整個群體的遺傳多樣性。本研究所構(gòu)建的核心種質(zhì)僅占野核桃總體的9.67%也說明了這一點(diǎn)。

新疆伊犁鞏留縣野核桃內(nèi)的野核桃是一個相對封閉的聚居群，野核桃群體數(shù)量巨大，形態(tài)性狀等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采集十分困難，特別是果實(shí)性狀數(shù)據(jù)無法采集全面 (因?yàn)橐昂颂覝蟽?nèi)許多野核桃樹不結(jié)果，課題組以每株至少20粒野核桃果實(shí)的數(shù)量進(jìn)行采集，經(jīng)過2年2批次的采集僅采集到418株的野核桃果實(shí))。因此分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的獲取就顯得相對易行。另外，分子標(biāo)記數(shù)據(jù)并不像形態(tài)性狀等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)那樣易受環(huán)境影響，分子數(shù)據(jù)更具有穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。

在構(gòu)建野核桃核心種質(zhì)過程中，受到樣本巨大、時間緊迫等客觀因素制約，所以僅采用了一種分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn) (僅有13對SSR分子標(biāo)記引物)和一種構(gòu)建核心種質(zhì)的方法。這有待于后來的研究者在采用其他分子標(biāo)記、增加引物和運(yùn)用不同構(gòu)建方法等方面來完善。另外，在野核桃基礎(chǔ)數(shù)據(jù)逐步完善的情況下，采用基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)相結(jié)合的方法，也是切實(shí)可行的。

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