肺癌中EML4-ALK融合基因的存在狀態(tài)及生物學(xué)功能

楊統(tǒng) 綜述 劉紅雨 陳軍 審校

肺癌是當(dāng)前世界上最常見的惡性腫瘤，主要包括小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩類，而NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%。盡管外科手術(shù)技術(shù)不斷提高，化療新藥不斷上市并進(jìn)入臨床應(yīng)用，但肺癌患者的預(yù)后仍然很差，原因是大多數(shù)NSCLC患者確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。同時(shí)部分臨床診斷為早期的肺癌患者，手術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。長(zhǎng)期以來，化療在晚期NSCLC的治療中占據(jù)主要地位，1995年進(jìn)行的meta分析顯示，以鉑類為基礎(chǔ)的化療相對(duì)于支持治療可以提高患者存活率[1]。20世紀(jì)90年代，第三代化療藥物有了較大進(jìn)展，多西紫杉醇、紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱、吉西他濱等藥物應(yīng)用于肺癌患者。然而，以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案在晚期（IIIb或IV）NSCLC患者中，緩解率（response rate,RR）為30%-40%，中位生存期僅為8個(gè)月-10個(gè)月[2]。如何更好而有效地改善NSCLC患者的生存率和生存時(shí)間，提高治療效果，成為臨床和科研工作者的一個(gè)研究方向和目標(biāo)。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了一些針對(duì)細(xì)胞特定分子的分子靶向治療藥物，這些藥物針對(duì)性強(qiáng)，能特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。其中，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinases inhibitors, EGFR-TKI）的分子靶向治療受到了極大的關(guān)注。目前，有兩種EGFR-TKI（厄洛替尼和吉非替尼）成功在中國(guó)上市，其藥物特點(diǎn)是口服、高效、高特異性，病人耐受性好，無骨髓抑制和神經(jīng)毒性，能明顯延長(zhǎng)敏感患者生存期[3]，改善患者生活質(zhì)量。但是，相關(guān)的臨床研究[4,5]結(jié)果顯示吉非替尼對(duì)東方人NSCLC的有效率為25%-35%，對(duì)西方人的有效率僅為8%-15%，臨床研究表明腺癌、女性、非吸煙、亞裔的NSCLC患者獲益明顯。

2010年，日本學(xué)者[6]研究了具有EGFR 19外顯子缺失突變和21外顯子L858點(diǎn)突變的病例，比較單純使用吉非替尼組與單純使用順鉑加紫杉醇組的生存時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，在具有突變的患者中，使用吉非替尼者的生存時(shí)間較單純使用化療藥長(zhǎng)（9.2個(gè)月 vs 6.3個(gè)月），而在不具有EGFR外顯子突變的非吸煙腺癌患者中，單純使用吉非替尼者的生存時(shí)間也較單純使用鉑類化療藥物的時(shí)間延長(zhǎng)。因此，在亞洲的非吸煙腺癌患者中，使用EGFR-TKI靶向藥物吉非替尼的療效優(yōu)于傳統(tǒng)的化療，這無疑是肺癌治療史上的一個(gè)巨大的進(jìn)步。

然而，2007年，日本學(xué)者在腺癌患者中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)亞群，這部分患者具有人類棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4（echinoderm microtubule-associated- protein-like 4, EML4）和人類間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）重排形成的融合基因，即EML4-ALK融合基因，對(duì)EGFRTKI治療和傳統(tǒng)的化療不敏感，而可能對(duì)ALK抑制劑敏感[7]。后來的研究發(fā)現(xiàn)，具有EML4-ALK重排的患者有其獨(dú)特的臨床病理生理特征，提示其治療有別于一般的腺癌，本文就EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)及研究現(xiàn)狀作一綜述。

圖1 EML4-ALK融合基因形成示意圖Fig 1 Schematic representation of fusion junctions and flanking sequences of the EML4-ALK fusion gene. Fusion of the N-terminal portion of EML4 (comprising the basic region, the HELP domain and part of the WD-repeat region) to the intracellular region of ALK(containing the tyrosine kinase domain).

1 EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)

2007年日本學(xué)者Soda等[7]在一名62歲男性吸煙肺腺癌患者手術(shù)標(biāo)本中擴(kuò)增出一個(gè)由3,926個(gè)堿基組成的cDNA片段，編碼一個(gè)由1,059個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白的氨基端（殘基1-496）是EML4編碼蛋白的一部分，而羧基端（殘基497-1,059）則由ALK編碼蛋白的一部分構(gòu)成，提示這個(gè)cDNA片段由是EML4和ALK的融合形成。此病例的EGFR和KRAS基因均為野生型。如圖1所示，該融合基因定位于2號(hào)染色體的短臂上（2p21和2p23），其5'端為EML4的片段，3'端為ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段與殘余的ALK片段連接。該融合基因擁有EML4基因中的basic區(qū)域、疏水的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白區(qū)（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein, HELP）以及部分WD重復(fù)區(qū)（后兩部分在部分亞型中缺失）和ALK基因中的Kinase功能區(qū)；此外在75個(gè)病例中發(fā)現(xiàn)了另外5例也具有EML4-ALK融合基因，因此，提示具有EML4-ALK融合基因的患者可能為NSCLC的一個(gè)特殊群體。

目前，已至少發(fā)現(xiàn)了14種EML4-ALK的變異體。這些變異體均有功能，均為EML4的不同外顯子與ALK的20外顯子相融合。變種1（V1），為EML4的第13外顯子與ALK的第20外顯子相連；變種2（V2），為EML4的第20外顯子與ALK的第20外顯子相連[7]；變種3（V3），有兩個(gè)亞變種（V3a/b），V3a為EML4的第6外顯子與ALK的第20外顯子相連，而V3b為EML4的第6外顯子加上一個(gè)33 bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連[8]；變種4（V4），為EML4的第14外顯子加上一個(gè)11 bp的小片段再與前面缺失49 bp的ALK的第20外顯子相連；變種5（V5），有兩個(gè)亞變種（V5a/b），V5a為EML4的第2外顯子與ALK的第20外顯子相連，而V3b為EML4的第2外顯子加上一個(gè)117 bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連[9]；變種6（V6），為EML4的第13外顯子加上一個(gè)49 bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連；變種7（V7），為EML4的第14外顯子與前面缺失12 bp的ALK的第20外顯子相連；變種8（“V4”），為EML4的第15外顯子缺失了后面19 bp再與前面缺失20 bp的ALK的第20外顯子相連；變種9（“V5”），為EML4的第18外顯子與ALK的第20外顯子相連[10]。

2 EML4-ALK融合基因陽(yáng)性患者的病理生理學(xué)特征

幾乎所有研究均顯示EML4-ALK融合基因主要存在于NSCLC中，其出現(xiàn)頻率為5%-10%。研究顯示EML4-ALK融合基因陽(yáng)性患者多為不吸煙或少吸煙的腺癌患者，多伴隨印戒細(xì)胞樣改變，與EGFR突變相比，EML4-ALK融合基因多出現(xiàn)于男性，較EGFR突變者年輕，在亞洲人群中出現(xiàn)的比例較大；與EGFR突變和KRAS突變多不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)，即具有EML4-ALK融合基因的患者多為EGFR和KRAS野生型，而EGFR和/或KRAS突變的患者多不具有EML4-ALK融合基因[11,12]。EGFR-ALK患者對(duì)EGFRTKI治療不敏感，表現(xiàn)為對(duì)TKI治療的原發(fā)性耐藥；比較EML4-ALK陽(yáng)性組與陰性組后發(fā)現(xiàn)兩組患者對(duì)鉑類藥物的治療效果無明顯差異，總的生存時(shí)間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[13]。

3 EML4-ALK融合基因可能的生物學(xué)功能

EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)者Soda等將攜帶EML4-ALK基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3，而使后者獲得了致瘤性，接種于裸鼠皮下后成瘤。而在攜帶EML4-ALK的所有轉(zhuǎn)基因小鼠的肺組織中，自發(fā)性形成數(shù)百個(gè)腺癌病灶。這種轉(zhuǎn)基因的小鼠在口服ALK激酶的抑制劑后，腫瘤均趨于消失；而在靜脈注射轉(zhuǎn)染EML4-ALK的3T3細(xì)胞后，小鼠均由于呼吸衰竭而死亡，而使用ALK激酶抑制劑后，能明顯延長(zhǎng)這些小鼠的生存時(shí)間。使用特異的siRNA沉默EML4-ALK融合基因后，能抑制相關(guān)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。這些均提示EML4-ALK基因在肺癌的形成過程中起著重要的作用。

研究者研究了EML4-ALK融合基因的各個(gè)功能區(qū)，其中，EML4基因片段中的basic區(qū)及ALK基因的kinase區(qū)在各個(gè)亞型中均包含。后者為ALK基因的膜內(nèi)催化區(qū)域，其激活后通過相關(guān)信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、存活、遷移密切相關(guān)。EML4基因片段扮演著能使該融合基因產(chǎn)物蛋白二聚化的功能，因?yàn)锳LK基因的膜內(nèi)催化區(qū)域能在形成二聚體時(shí)激活，其異常激活導(dǎo)致細(xì)胞的癌變。Soda等[7]構(gòu)建缺失EML4 Basic區(qū)、HELP區(qū)、WD區(qū)質(zhì)粒的3T3細(xì)胞，接種裸鼠后發(fā)現(xiàn)缺失EML4 Basic區(qū)完全不能成瘤，而缺失HELP區(qū)和WD區(qū)均能成瘤，但瘤體較小，提示各功能區(qū)在肺癌的轉(zhuǎn)化過程中均發(fā)揮作用，但Basic區(qū)的作用可能最為重要。

對(duì)于EML4-ALK融合基因信號(hào)通路的研究，與其它ALK基因重排的融合基因一樣，都是對(duì)ALK基因信號(hào)通路的研究，都是通過激活A(yù)LK基因的膜內(nèi)催化區(qū)域達(dá)到細(xì)胞癌變的效果。目前研究發(fā)現(xiàn)其與STAT3、AKT/PI3K及RAS/ERK三條信號(hào)通路有關(guān)系。轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ（CCAAT/enhancer binding protein beta）具有提高細(xì)胞增殖和生存的能力。ALK基因通過STAT3信號(hào)通路提高C/EBPβ的mRNA及蛋白水平，還通過ERK1/2磷酸化C/EBPβ的第235位蘇氨酸激活C/EBPβ蛋白[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)ALK也可以通過SHH/GLI1信號(hào)通路發(fā)揮作用，且可激活A(yù)KT/PI3K信號(hào)通路穩(wěn)定GLI1蛋白。

4 EML4-ALK融合基因的檢測(cè)方法

自從該融合基因發(fā)現(xiàn)以來，為尋找更簡(jiǎn)便和更準(zhǔn)確的方法，研究人員做了各方面大量的研究。目前最常用的方法是反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。RT-PCR是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。利用手術(shù)切除標(biāo)本或其他標(biāo)本，提取總RNA后進(jìn)行RT-PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳以確定是否含有EML4-ALK融合基因。通過對(duì)各種不同亞型進(jìn)行專門引物的設(shè)計(jì)，可以分辨出各種不同亞型的EML4-ALK融合基因。

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization,FISH）也是常用的方法。 FISH是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號(hào)，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其它細(xì)胞器中的定位。通過對(duì)EML4基因及ALK基因進(jìn)行熒光標(biāo)記，在熒光顯微鏡下查看這兩種基因的位置關(guān)系判斷是否有染色體易位，以確定是否有EML4-ALK融合基因[17]。

Western blot的方法也是檢測(cè)EML4-ALK融合基因的方法之一。Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。Western blot主要用來確定EML4-ALK融合基因是否表達(dá)及表達(dá)情況。

除了以上幾種常用的方法外，還有其它各種常規(guī)或新的方法。Zhang等[18]使用了一種RACE-coupled PCR的方法，也很好地檢測(cè)出了EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的樣本。Takeuchi等[19]發(fā)現(xiàn)了一種新的檢測(cè)ALK相關(guān)融合基因的免疫組化方法-iAEP（antibody-enhanced polymer）。該法將ALK蛋白的不同區(qū)域分別做出相應(yīng)的特異性抗體，然后用這些抗體特異檢測(cè)標(biāo)本中ALK蛋白不同區(qū)域的表達(dá)情況。若5'端的區(qū)域與3'端的區(qū)域表達(dá)差異較大，則說明有ALK融合基因。表1列出了文獻(xiàn)[7,9,11,13,14,18-25]報(bào)道的檢測(cè)EML4-ALK的方法及陽(yáng)性率。

表1 文獻(xiàn)所用檢測(cè)EML4-ALK的方法及陽(yáng)性率Tab 1 EML4-ALK fusion gene previously reported by the literatures in lung cancer

5 展望

目前在NSCLC中EML4-ALK融合基因的亞型已經(jīng)有14種。Lin等[14]發(fā)現(xiàn)一種EML4的21外顯子與ALK的20外顯子融合而成的新亞型，但僅在大腸癌中出現(xiàn)，并未在肺癌中檢測(cè)到，或許更敏感的檢測(cè)方法或更大樣本量的檢測(cè)能發(fā)現(xiàn)更多新的亞型。

現(xiàn)在對(duì)EML4-ALK融合基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面的研究還剛開始，相信這部分的研究將是以后的重點(diǎn)。如果信號(hào)通路明確的話，可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的藥物，這將對(duì)治療有極大的幫助。實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的細(xì)胞系及EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的小鼠進(jìn)行一些嘗試性的治療，觀察細(xì)胞系的生長(zhǎng)情況及小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)其對(duì)吉非替尼耐藥，對(duì)鉑類藥物低反應(yīng)，但ALK抑制劑對(duì)其有效，能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)[13,26]。

由于目前在臨床上相關(guān)特征并無超大樣本的統(tǒng)計(jì)資料，對(duì)一些特征還是比較難以把握，并且一些更常規(guī)高效的檢測(cè)方法有待研究，EML4-ALK融合基因檢測(cè)真正應(yīng)用于臨床還有一定的距離。

綜上所述，EML4-ALK融合基因存在于NSCLC中，很有可能成為在EGFR突變與KRAS突變之外的另一個(gè)重要的分子靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究可能會(huì)展現(xiàn)出與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、治療及評(píng)估等方面相關(guān)的新領(lǐng)域。