代謝組學(xué)方法分析肺癌患者血清和尿液小分子代謝產(chǎn)物的初步研究

牛艷潔 江銀玲 許長江 王向迎 劉友如 趙珩 韓寶惠 姜麗巖

肺癌是當(dāng)今世界各國最常見的惡性腫瘤之一。2008年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌在所有癌癥新發(fā)病例和死亡病例中分別占13%和18%，已居男性癌癥發(fā)病率和死亡率首位，在女性癌癥死因中也居第2位[1]。我國的回顧性調(diào)查研究[2]發(fā)現(xiàn)，近40年來肺癌在癌癥死亡中的構(gòu)成也由7.35%上升至22.70%，從第5位的癌癥死因躍居第1位。由于肺癌起病隱匿，大多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期，失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而臨床診斷Ia期與IV期肺癌患者的5年生存率從50%下降到2%[3]，因此早期診斷是降低肺癌死亡率的重要措施。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物對惡性腫瘤的篩查有重要的臨床價(jià)值，而現(xiàn)有的傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物對于肺癌的診斷尚缺乏特異性與靈敏度。

代謝組學(xué)是對某一生物或細(xì)胞所有小分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一門新興學(xué)科，其揭示的小分子代謝產(chǎn)物變化是機(jī)體內(nèi)基因、蛋白質(zhì)/酶等功能變化的一系列事件的最終結(jié)果，直接反映了生物體系的最終狀態(tài)，可以反映機(jī)體特定病理生理狀態(tài)下整體代謝物質(zhì)的變化，為疾病的診斷提供了新的研究思路[4]。目前隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的腫瘤相關(guān)代謝標(biāo)志物在腫瘤疾病中被鑒定[5]，相關(guān)的研究主要集中在乳腺癌[6]、卵巢癌[7]、前列腺癌[8]等方面。而針對肺癌的代謝組學(xué)研究處于起步階段，尚未有應(yīng)用代謝組學(xué)方法檢測肺癌患者血清和尿液小分子代謝產(chǎn)物的聯(lián)合分析報(bào)道。本研究通過氣相色譜/質(zhì)譜（gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS）化學(xué)衍生法分析初治肺癌與其它肺部疾病患者血清和尿液的小分子代謝產(chǎn)物，以探討代謝組學(xué)方法在肺癌診斷中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 病理或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的19例肺癌患者作為肺癌組，15例其它肺部疾病患者作為對照組。肺癌組年齡分布31歲-71歲，男性17例、女性2例；腺癌10例、鱗癌6例、小細(xì)胞肺癌3例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）第七版肺癌TNM分期，I期、II期、III期、IV期患者分別為3例、5例、7例、4例；有吸煙史患者11例。對照組年齡分布18歲-68歲，男性9例、女性6例；肺炎5例、支氣管擴(kuò)張3例、肺結(jié)核5例、肺錯(cuò)構(gòu)瘤1例、肺淋巴瘤1例；有吸煙史患者6例。由于代謝產(chǎn)物受多種因素的影響，如患者飲食習(xí)慣、合并癥、藥物使用情況等，為了盡量減少各種其它因素對研究結(jié)果的影響，所有入組病例都作以下篩選：①均為非素食者；②無代謝性疾病和長期服藥史；③肺癌患者入組前未接受任何抗腫瘤治療，體力狀態(tài)（performance status,PS）評分＜2分。入組前均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集 收集入選患者空腹血標(biāo)本4 mL于無菌促凝BD真空采血管中，2,000 rpm（臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)TDL-5M）、4oC離心5 min，取上層血清，與同時(shí)留取的尿液5 mL共同保存于-80oC冰箱中待用。

1.3 血清樣本預(yù)處理 將低溫保存的血清樣本放置室溫解凍搖勻，取100 μL加入內(nèi)標(biāo)十七酸10 μL混勻。再加入甲醇：氯仿（3:1）混合溶液300 μL，振蕩30 s，置于-20oC冰箱中10 min。以10,000 rpm（高速冷凍離心機(jī)GL21M，KAIDA）離心10 min，取上清液300 μL加入進(jìn)樣瓶，室溫N2吹干后加入甲氧胺吡啶溶液80 μL，振蕩30 s，置于30oC搖床以200 rpm（恒溫振蕩器HZ-9201K）反應(yīng)90 min。最后加入80 μL硅烷化試劑[Bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSTFA]+1%三甲基硅烷（Trimethylsilyl Compounds, TMCS），振蕩30 s，在70oC烘箱反應(yīng)60 min，振蕩30 s。室溫放置1 h后準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.4 尿液樣本預(yù)處理 將低溫保存的尿液樣本在室溫解凍搖勻，取1 mL以12,000 rpm（高速冷凍離心機(jī)GL21M，KAIDA）離心10 min后取上清200 μL，加入30 U尿素酶，振蕩30 s后37oC水浴15 min去除尿素；再加入800 μL甲醇，10 μL內(nèi)標(biāo)十七酸，振蕩1 min，13,000 rpm離心10 min，取上清液200 μL加入進(jìn)樣瓶，室溫N2吹干后加入50 μL甲氧胺吡啶溶液，振蕩1 min，置于30oC搖床以200 rpm（恒溫振蕩器HZ-9201K）反應(yīng)90 min，然后加入50 μL BSTFA+1%TMCS，振蕩30 s，在70oC烘箱反應(yīng)60 min，振蕩30 s，最后加入40 μL庚烷，振蕩30 s，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.5 氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）分析條件 氣相色譜條件：系統(tǒng)載氣氦氣，流速1 mL/min。血清檢測色譜柱升溫程序：起始溫度80oC保持2 min，以10oC/min升溫至180oC后即刻以5oC/min升溫至240oC，再以25oC/min升溫至290oC保持9 min，進(jìn)樣口溫度270oC，接口溫度260oC。尿液檢測色譜柱升溫程序：起始溫度70oC保持2 min，以10oC/min升溫至170oC后即刻以5oC/min升溫至240oC，再以20oC/min升溫至300oC保持6 min，進(jìn)樣口溫度260oC，接口溫度270oC。質(zhì)譜條件：溶劑延時(shí)5 min，離子源溫度200oC，電子轟擊電離，電子能量70 eV，全掃描范圍（m/z）30-600。取預(yù)處理后血清或尿液樣品1 μL進(jìn)樣。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì) 記錄每個(gè)血清及尿液樣本的總離子流色譜圖（total ions chromatogram, TIC），將TIC導(dǎo)入美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards Technology, NIST）8.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中，逐個(gè)分析每個(gè)樣本的總離子流色譜圖的每個(gè)峰，在NIST 8.0質(zhì)譜庫中檢索相應(yīng)的化合物，選擇匹配度較好的化合物。以代謝物峰面積與內(nèi)標(biāo)十七酸峰面積比值來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，將GC/MS分析得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成通用數(shù)據(jù)格式（common data format,CDF），并進(jìn)行峰數(shù)據(jù)提取，得到質(zhì)荷比、保留時(shí)間和譜峰編號(hào)的三維信息，再將此信息導(dǎo)入SIMCA-P 12.0+軟件中進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，采用監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析法（orthogonal to partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）進(jìn)行建模分析。運(yùn)用兩樣本的t檢驗(yàn)比較肺癌組和其它肺部疾病組的代謝產(chǎn)物水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尋找差異性代謝產(chǎn)物。以肺癌組與其它肺部疾病組的比值表示該物質(zhì)在肺癌患者的相對水平，＞1表示該物質(zhì)在肺癌患者中升高，＜1表示該物質(zhì)在肺癌患者中降低。

2 結(jié)果

2.1 血清GC/MS檢測分析結(jié)果 根據(jù)NIST 8.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析鑒定血清樣本的TIC，得到匹配度較好的代謝物共57種（表1），OPLS-DA法分析肺癌組和其它肺部疾病組患者血清樣本的二維分布結(jié)果（圖1A）所示肺癌組主要位于第1、4象限，其它肺部疾病組主要位于第2、3象限，可見兩組有明顯的分離趨勢，并根據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果鑒定得到13種差異性代謝產(chǎn)物（表2）。

2.2 尿液GC/MS檢測分析結(jié)果 根據(jù)NIST 8.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析鑒定尿液樣本的TIC，得到匹配度較好的代謝物共38種（表3），OPLS-DA法分析肺癌組和其它肺部疾病組患者尿液樣本的二維分布結(jié)果（圖1B）所示肺癌組主要位于第1、4象限，其它肺部疾病組主要位于第2、3象限，可見兩組有明顯的分離趨勢，并根據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果鑒定得到7種差異性代謝產(chǎn)物（表4）。

3 討論

目前己知的肺癌腫瘤標(biāo)志物主要有激素、胚胎蛋白、細(xì)胞表面膜抗原、酶類及某些細(xì)胞因子等[9]，臨床應(yīng)用比較廣泛的有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）、細(xì)胞角蛋白19片斷抗原（cytokeratin fragment antigen 21-1, CYFRA21-1）及鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原等。單一標(biāo)志物對肺癌的診斷價(jià)值有限，目前已傾向多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測的方法，以提高肺癌診斷的特異性和敏感性[10]。但與肺癌有關(guān)的眾多標(biāo)志物在肺癌診斷的敏感性及特異性方面仍不令人滿意，嘗試用各種新方法來探索肺癌相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

表1 肺癌及其它肺部疾病患者血清質(zhì)譜峰保留時(shí)間，物質(zhì)名稱及符合度列表Tab 1 Serum metabolites of lung cancer and other lung diseases

表2 肺癌患者組和其它肺部疾病組間的血清差異性代謝物Tab 2 Significantly changed metabolites in serum of lung cancer and other lung diseases

表3 肺癌及其它肺部疾病患者尿液質(zhì)譜峰保留時(shí)間、物質(zhì)名稱及符合度列表Tab 3 Urine metabolites of lung cancer and other lung diseases

表4 肺癌患者組和其它肺部疾病組間的尿液差異性代謝物Tab 4 Significantly changed metabolites in urine of lung cancer and other lung diseases

圖1 肺癌組與其它肺部疾病組血清樣本（A）和尿液樣本（B）OPLS-DA代謝模式識(shí)別圖。藍(lán)色圓點(diǎn)代表肺癌患者，紅色菱形代表其它肺部疾病患者。Fig 1 OPLS-DA scores plot discriminating serum(A) and urine (B) samples of lung cancer patients and patients with other lung diseases based on the metabolite profiling data. Blue circles indicate lung cancer patients; red diamonds indicate patients with other lung diseases.

代謝組學(xué)是繼基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組之后，應(yīng)運(yùn)而生并在近幾年蓬勃發(fā)展，逐步應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新興學(xué)科，它利用高通量的分離與檢測技術(shù)盡可能多的識(shí)別樣品中的小分子代謝物質(zhì)，是一種全面反映機(jī)體各個(gè)器官功能狀態(tài)的檢測方法。隨著衍生化試劑和方法的創(chuàng)新，GC/MS開始廣泛運(yùn)用于代謝組學(xué)，并逐漸趨于成熟[11]。本研究通過應(yīng)用該技術(shù)，分析肺癌和其它肺部疾病患者的血清及尿液小分子代謝產(chǎn)物，采用OPLS-DA建模，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清及尿液的代謝模式都出現(xiàn)明顯的分離趨勢，提示肺癌患者與其它肺部疾病患者由于在不同的病理狀態(tài)表現(xiàn)出的代謝譜特征有明顯差異。本研究結(jié)果為今后擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)一步驗(yàn)證代謝組學(xué)方法在肺癌診斷方面的準(zhǔn)確性以及分析不同分期及病理類型肺癌患者代謝譜特征奠定了基礎(chǔ)，從而將代謝組學(xué)技術(shù)逐步引入肺癌的診斷技術(shù)領(lǐng)域，為肺癌的診斷探索新的研究方向。

代謝組學(xué)方法檢測出的一系列小分子代謝產(chǎn)物是機(jī)體在特定環(huán)境下（如病理狀態(tài)或藥物治療后），經(jīng)過復(fù)雜的生化反應(yīng)后在血液或尿液表現(xiàn)出來的最終結(jié)果，其在肺癌的診斷應(yīng)用有別于通常概念的腫瘤標(biāo)志物，建立一個(gè)有特殊鑒別能力的小分子代謝物群組是代謝組學(xué)方法主要的檢測目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)的13種血清差異代謝產(chǎn)物分別為：乳酸、丙酮酸、檸檬酸、丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸、2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、乙二酸、十六酸、亞油酸、甘油和核糖醇，其中只有賴氨酸與核糖醇在肺癌組下降，其余11種物質(zhì)在肺癌組水平均高于其它肺部疾病組。7種尿液差異代謝產(chǎn)物分別為肌酐、肌醇、3-羥基丁酸、核苷酸、檸檬酸、十六酸、油酸，除了核苷酸在肺癌組下降外，其余6種物質(zhì)在肺癌組水平均高于其它肺部疾病組。這些物質(zhì)中有些在相關(guān)研究被發(fā)現(xiàn)并提示了與腫瘤的關(guān)系，如乳酸、丙酮酸的增高可能是由于腫瘤組織中Warburg效應(yīng)的存在[12]，是腫瘤細(xì)胞能量代謝異常即糖酵解增強(qiáng)的結(jié)果；丙氨酸的增高與細(xì)胞膜合成代謝增強(qiáng)有關(guān)，這在多項(xiàng)前列腺癌的研究[13,14]中均有發(fā)現(xiàn)；十六酸、亞油酸、油酸作為細(xì)胞膜的重要組成成分，其含量水平與細(xì)胞增殖、壞死和凋亡緊密相關(guān)，目前已在多種類型腫瘤中發(fā)現(xiàn)其水平的改變，如腦腫瘤[15]、肉瘤[16]、前列腺癌[17]等；肌醇是脂肪代謝的前體，主要起調(diào)節(jié)滲透壓、營養(yǎng)細(xì)胞、抗氧化及生成表面活性物質(zhì)的作用，因此細(xì)胞增殖加速時(shí)增高，多見于星形膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中可見增高[18]；核苷酸是組成脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）的重要物質(zhì)，在脂肪酸和糖代謝中是一個(gè)關(guān)鍵的中間代謝物，在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）濃聚物中的改變是腫瘤活力狀態(tài)的重要指示物。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者尿液中核苷酸含量低于其它肺部疾病患者，提示可能與腫瘤生長消耗大量核苷酸有關(guān)。雖然還有一些物質(zhì)尚未在研究報(bào)道中明確與腫瘤的關(guān)系，但作為代謝群組中有意義的產(chǎn)物，仍能應(yīng)用于肺癌的診斷，且隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及腫瘤基礎(chǔ)研究的深入，更多的物質(zhì)將被揭示出與腫瘤的關(guān)系，從而為腫瘤的診斷與治療提供更寬廣的研究思路。代謝組學(xué)方法在分子水平輔助診斷肺癌，未來作為新技術(shù)應(yīng)用于肺癌的診斷有一定的前景。