表皮生長因子受體突變細胞系H1650耐藥機制探討

韓瑞麗 王小麗 鐘殿勝 趙娟 陳哲 孫琳琳 王競 張金棒

肺癌主要分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC），其中80%-85%為NSCLC。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的診療技術(shù)已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)倪M展，采取了手術(shù)為主、放化療等綜合治療手法，肺癌總的5年生存率仍只有13%-15%[1]。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）在50%-90%的NSCLC患者中高表達，參與腫瘤的血管新生、遷移和粘附過程，其擴增和突變已被認為是肺部腫瘤發(fā)生的主要機制之一。厄洛替尼（Erlotinib, Tarceva）是EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI），通過特異性結(jié)合在EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域抑制EGFR活化而發(fā)揮抗瘤作用[4]。本研究探討了NSCLC細胞系EGFR基因的表達水平及其抑制劑Erlotinib對NSCLC細胞系的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC細胞系A(chǔ)549、H460、H157、H1299、H1792、CALU-1、H1650、H1975和HCC827購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection,ATCC）。RPMI-1640培養(yǎng)基、新生小牛血清購于GIBCO公司；Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Premix Ex Taq購自TAKARA公司，MTT試劑盒購于美國Promega公司，p-AKT、p-ERK、AKT、ERK、PTEN抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司，二抗HRP-羊抗兔IgG、二抗羊抗鼠IgG購于北京中杉生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購于美國Amersham Biosciences。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素配制成1640完全培養(yǎng)基，37oC、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，0.125%胰酶消化傳代，3 d-4 d傳一代。所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 Real-time RT-PCR 用Trizol試劑提取處于對數(shù)生長期細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA，使用realtime RT-PCR技術(shù)檢測基因的表達情況。PCR引物序列為：EGFR：Forward：GCGTTCGGCACGGTGTATAA；Reverse：GGCTTTCGGAGATGTTGCTTC；參照基因GAPDH：Forward：GGAGTCAACGGATTTGGTCG；Reverse：CTGATTGGAGGGATCTCG，擴增長度為240 bp。PCR擴增體系20 μL，第一步：預(yù)變性 95oC、30 s、1個循環(huán)，第二步：PCR反應(yīng)：95oC、5 s，60oC、34 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCT法計算EGFR基因表達差異。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)胰酶消化制成單細胞懸浮液，以每孔約5×103個細胞接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)過夜后棄去原液，分別加入終濃度為1×10-3μM/L、1×10-2μM/L、1×10-1μM/L、1 μM/L、10 μM/L和20 μM/L的Erlotinib，對照組加入等量的培養(yǎng)基，每組設(shè)4個復(fù)孔，72 h后進行MTT試驗，并繪制細胞生長曲線。

1.2.4 Western blot方法 按照文獻[5]，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4oC過夜，二抗室溫1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑工作液進行蛋白信號檢測，GAPDH作為蛋白加樣對照。

2 結(jié)果

2.1 EGFR野生型NSCLC細胞系中EGFR mRNA表達水平及與Erlotinib細胞毒性相關(guān)性的研究

2.1.1 EGFR野生型NSCLC細胞系中EGFR mRNA表達水平利用real-time RT-PCR技術(shù)檢測了6種EGFR野生型NSCLC細胞系中EGFR mRNA表達水平。實驗結(jié)果顯示（圖1），H157表達水平最低；A549和CALU-1表達水平相對較低；H460和H1792表達水平較高；H1299表達水平最高，約為H157的2,621倍，為EGFR高表達的細胞系。

圖 1 EGFR野生型NSCLC細胞系中EGFR mRNA表達水平Fig 1 The epidermal growth factor receptor (EGFR) mRNA expression level in EGFR wild-type non-small cell lung cancer (NSCLC) cells

圖 2 MTT方法檢測EGFR野生型NSCLC細胞對Erlotinib藥物敏感性Fig 2 The measurement of cytotoxicity for EGFR wild-type NSCLC cells to Erlotinib by MTT assay

圖 3 Western blot方法檢測EGFR的突變情況Fig 3 The EGFR mutations in H1975, H1650 and HCC827 cells

圖 4 MTT檢測EGFR突變細胞系對Erlotinib藥物敏感性Fig 4 The measurement of cytotoxicity for EGFR-mutant NSCLC cells to Erlotinib by MTT assay

2.1.2 Erlotinib對上述細胞系的毒性作用 6株細胞系分別在7個濃度梯度的Erlotinib培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h，利用MT方法檢測細胞毒性，結(jié)果顯示（圖2）：隨著藥物濃度的倍增，Erlotinib對各細胞系的生長抑制作用并沒有明顯增強，均表現(xiàn)為明顯的耐藥性。其中在1 μM Erlotinib的濃度，H157細胞系的生長抑制率約為10%，A549和Calu-1的生長抑制率約為0，H460和H1792細胞系的生長抑制率分別約為12%和15%，而高表達EGFR的H1299細胞系的生長抑制率為0；在10 μM Erlotinib的濃度，H157細胞系的生長抑制率為24%，A549和Calu-1細胞系的生長抑制率分別約為10%和2%，H460和H1792的生長抑制率分別約為20%和21%，H1299的生長抑制率8%。上述結(jié)果表明，EGFR野生型NSCLC細胞系對Erlotinib耐藥，且Erlotinib的細胞毒性與EGFR mRNA表達水平高低無關(guān)。

2.2 Erlotinib對EGFR突變型NSCLC細胞系毒性作用的研究 肺癌中EGFR突變多見于外顯子18-21，即胞內(nèi)酪氨酸激酶編碼區(qū)，最常見突變形式包括外顯子19的E746-A750del和外顯子21的L858R點突變，這兩種突變約占EGFR突變的85%-90%[6]，發(fā)生這兩種突變的腫瘤細胞對EGFR-TKIs敏感，稱為活化突變。部分腫瘤細胞可發(fā)生二次突變，最常見二次突變?yōu)橥怙@子20的T790M突變，為耐藥突變[7]。

H1650和HCC827細胞系均為EGFR外顯子19的E746-A750del突變，H1975細胞系為外顯子21 L858R點突變，但同時伴有外顯子20的T790M二次突變。我們利用Western blot驗證了上述3種NSCLC細胞系中EGFR的突變情況（圖3）。

3株細胞系分別在7個濃度梯度Erlotinib的培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h，細胞毒性實驗結(jié)果顯示（圖4），Erlotinib能夠明顯抑制HCC827的生長，呈明顯的濃度相關(guān)性，IC50為0.03 μM；H1975對Erlotinib高度耐藥，這些結(jié)果均與預(yù)期的一致。但實驗結(jié)果顯示，H1650細胞系對Erlotinib相對耐藥，約為HCC827的167倍，與預(yù)期的推測不一致。

2.3 Erlotinib對H1650細胞信號傳導(dǎo)途徑的影響 EGFR主要的信號傳導(dǎo)通路包括：Ras/Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT通路。EGFR與EGFR-TKI結(jié)合后，抑制EGFR本身磷酸化，從而抑制其下游相應(yīng)的信號蛋白的磷酸化。

我們用10 μM Erlotinib處理HCC827和H1650細胞2 h，結(jié)果顯示，在HCC827細胞中，AKT和ERK的磷酸化水平均明顯下調(diào)（圖5），提示Erlotinib可以明顯抑制其細胞內(nèi)EGFR下游的信號通路；在H1650細胞中，p-ERK水平呈明顯下降，但AKT的磷酸化水平無明顯下降（圖5）。

圖 5 Western blot方法檢測Erlotinib處理HCC827和H1650后p-ERK、p-AKT的表達水平Fig 5 HCC827 and H1650 cells were treated with Erlotinib for 2 h,Anti-p-AKT and anti-p-ERK antibody was used to detect AKT and ERK phosphorylation, with GAPDH as the loading control.

Sos等[8]發(fā)現(xiàn)在H1650細胞中有PTEN的缺失。我們實驗結(jié)果也證實了在H1650細胞中存在PTEN的缺失（圖6）。

圖 6 Western bot檢測HCC827和H1650細胞中PTEN的表達水平Fig 6 No PTEN protein detected in H1650 cells

蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen, PTEN）是具有蛋白與脂質(zhì)磷酸酯酶活性的雙特異性磷酸酯酶，能特異地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3'位脫磷酸，抑制Akt的磷酸化[9]。PTEN的缺失可以導(dǎo)致Akt的活化，從而可以解釋Erlotinib為什么不能抑制H1650細胞AKT磷酸化水平，但可抑制ERK的磷酸化。為了進一步探討H1650耐藥與PTEN表達缺失的相關(guān)性，我們用10 μM LY294002（PI3K抑制劑）處理H1650及HCC827細胞2 h，進而檢測p-AKT的水平，結(jié)果顯示（圖7）HCC827細胞的p-AKT明顯抑制，但對H1650細胞的p-AKT抑制作用不明顯，進一步證實了因為PTEN的缺失，H1650的AKT磷酸化水平不受其上游調(diào)節(jié)；因為LY294002對Ras/Raf/MEK/ERK通路無作用，所以兩種細胞系的p-ERK水平未被抑制（圖7）。

圖 7 Western blot檢測經(jīng)LY294002處理后的HCC827和H1650細胞系的p-AKT、p-ERK表達水平Fig 7 HCC827 and H1650 cells were treated with LY294002 (PI3K inhibitor) for 2 h, Anti-p-AKT and anti-p-ERK antibody was used to detect AKT and ERK phosphorylation, with GAPDH as the loading control.

綜合上述結(jié)果，H1650細胞系對Erlotinib相對耐藥可能與PTEN缺失導(dǎo)致AKT信號傳導(dǎo)通路異?；罨嘘P(guān)，而與Ras/Raf/MEK/ERK信號途徑無關(guān)。

3 討論

肺癌是死亡率最高的癌癥之一，其中約80%-85%為NSCLC[10]，由于約70%的患者在就診時已處于晚期，失去了手術(shù)的機會，且NSCLC對鉑類等化療藥物的反應(yīng)差，其5年生存率只有15%左右[11]。

EGFR是原癌基因C-erbB1的表達產(chǎn)物，屬于酪氨酸激酶生長因子受體家族成員之一，EGFR主要的信號傳導(dǎo)通路包括Ras/Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT通路。在腫瘤細胞中，EGFR基因突變和擴增可使EGFR酪氨酸激酶不恰當(dāng)激活，促進腫瘤的血管生成和腫瘤細胞的增殖、粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究[12]顯示，NSCLC伴轉(zhuǎn)移的患者中，60%以上存在EGFR過度表達，且與這些患者的預(yù)后密切相關(guān)，因此以EGFR為靶點的抗癌治療日益受到關(guān)注。EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶編碼區(qū)，多發(fā)生于基因外顯子18、19、20和21，與EGFRTKIs敏感性相關(guān)的主要是位于外顯子18、21的點突變和外顯子19的缺失突變。其中，外顯子21的點突變，使EGFR蛋白中該位點的氨基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔↙858R）；外顯子19第746-750位密碼子的缺失（19 exon E746-A750del）導(dǎo)致EGFR蛋白中氨基酸序列丟失，改變了受體絡(luò)氨酸激酶ATP結(jié)合槽的角度。

EGFR-TKIs通過與ATP競爭，結(jié)合于EGFR-TK胞內(nèi)端的催化區(qū)域（EGFR結(jié)構(gòu)域中高度保守的ATP結(jié)合位點），阻止EGFR的自磷酸化及下游的信號傳導(dǎo)。EGFRTKIs代表藥物，Gefitinib或Erlotinib，作為二線藥物已應(yīng)用于標準化療無效的NSCLC；對于存在EGFR突變的晚期NSCLC患者，EGFR-TKI一線化療藥物應(yīng)用于臨床已經(jīng)得到了專家的共識[13]。但隨著EGFR-TKI臨床應(yīng)用的日益增多，其耐藥現(xiàn)象已成為臨床工作中一大難題。 引起耐藥的原因多種多樣，主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥[14]，原發(fā)性耐藥機制包括KRAS突變[15]；繼發(fā)性耐藥機制主要包括EGFR外顯子20的T790M突變（蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔┖虲-MET擴增兩種，約占所有耐藥機制的70%，尚有30%-40%患者耐藥機制不清楚[16]。

本研究顯示，EGFR野生型NSCLC細胞系對Erlotinib均耐藥，且Erlotinib的藥物敏感性與EGFR的mRNA表達水平無關(guān)，但與EGFR突變類型相關(guān)；具有EGFR外顯子19缺失突變的H1650細胞對Erlotinib相對耐藥。Guo等[17]發(fā)現(xiàn)在H1650細胞株中，PTEN蛋白表達缺失，因此對AKT的抑制作用消失。Yamamoto等[18]用Gefitinib處理PC-9細胞系（存在EGFR外顯子19缺失突變）7個月后誘導(dǎo)出耐藥細胞系，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞系是由于PTEN蛋白表達缺失導(dǎo)致對Gefitinib耐藥的；他們用免疫組化的方法對4例Gefitinib獲得性耐藥的肺癌患者進行了治療前后PTEN蛋白表達水平的比較，其中3例患者PTEN表達水平明顯低于治療前，考慮PTEN蛋白表達水平的缺失與Gefitinib獲得性耐藥有關(guān)。我們的實驗結(jié)果也驗證了在H1650細胞中存在PTEN蛋白表達的缺失，同時發(fā)現(xiàn)Erlotinib雖然可以抑制H1650細胞中的p-ERK水平，但p-AKT的水平無明顯變化。因此推測，H1650對Erlotinib耐藥可能與PTEN缺失有關(guān)。進一步應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002處理H1650細胞，發(fā)現(xiàn)其也不能抑制H1650細胞的p-AKT水平，進一步證實H1650細胞p-AKT水平不受其上游調(diào)節(jié)，其對Erlotinib相對耐藥與PTEN表達缺失導(dǎo)致AKT信號傳導(dǎo)通路異?；罨嘘P(guān)，而與Ras/Raf/MEK/ERK信號途徑無關(guān)。

此外，亦有文獻報道H1650對Erlotinib的耐藥可能與抑制BIM上調(diào)[19]和腫瘤細胞從上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition, EMT）[20]有關(guān)，這些均有待于我們在未來的研究中進一步證實。