IL-8RB mRNA和IL-8RB蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達

白慧茹 崔春霞 宋芳 顧捷 蘇麗娟 劉薩日娜(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，010059)

IL-8RB mRNA和IL-8RB蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達

白慧茹 崔春霞 宋芳 顧捷 蘇麗娟 劉薩日娜(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，010059)

目的 研究妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中IL-8RB在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達情況。方法 應用半定量RT-PCR、免疫組織化學顯色和圖像分析技術(shù)，觀察IL-8RB在妊娠1 d、4 d、5 d、6 d小鼠子宮內(nèi)膜中的表達情況。結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果顯示在子宮內(nèi)膜腔上皮，IL-8RB于妊娠4 d表達最強，妊娠5 d開始逐漸下降，妊娠6 d降至妊娠1 d水平；在子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)，IL-8RB的表達水平隨妊娠天數(shù)的增加而逐漸升高。RT-PCR結(jié)果顯示IL-8RB mRNA表達規(guī)律與IL-8RB蛋白在子宮內(nèi)膜腔上皮的表達相一致。結(jié)論 IL-8RB可能通過與其配體白細胞介素-8結(jié)合而參與小鼠胚泡著床過程。

IL-8RB；子宮內(nèi)膜；著床；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應；免疫組織化學

目前已知白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的受體有IL-8RA(IL-8 receptor A)和IL-8RB，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體[1]，其中IL-8RB與IL-8的親和力強于IL-8RA。IL-8RB主要表達于中性粒細胞表面，正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的上皮細胞、基質(zhì)細胞也有表達[2]，但是其在妊娠早期子宮內(nèi)膜的表達情況尚不清楚。本研究運用半定量RT-PCR、免疫組織化學的方法檢測妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜IL-8RB的表達，為進一步闡述它在小鼠胚泡著床過程中的作用機制提供可能的動物實驗資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象 妊娠小鼠：昆明種動情期雌鼠與同品系雄鼠2∶1合籠，次日清晨發(fā)現(xiàn)陰栓者為妊娠1 d的小鼠。子宮內(nèi)膜組織標本：分別于妊娠1 d、4 d、5 d、6 d用斷頸法處死雌鼠，迅速剪開腹腔，取雙側(cè)子宮，標本分為兩份，一份用Bouin液固定，常規(guī)石蠟包埋；另一份凍存于－80℃，以供提取RNA用。

1.2 主要試劑 兔抗人IL-8RB多克隆抗體購于Santa Cruz公司；PV-6001免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RNArose Reagent購于上海華舜生物工程有限公司；通用RT-PCR試劑盒購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司；IL-8RB和內(nèi)參照β-actin的引物均委托大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 免疫組織化學染色 切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2去離子水室溫閉光孵育15 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶；滴加兔抗人IL-8RB多克隆抗體工作液(1∶150)，37℃恒溫箱中孵育2 h；滴加羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃恒溫箱中孵育30 min。以上各步之間用0.01M PBS緩沖液(pH 7.5)洗3次，每次5 min。最后，DAB室溫閉光顯色4 min，Mayer蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片。陰性對照用抗體稀釋液代替一抗，其他步驟同上。

1.4 RT-PCR法 使用RNArose Reagent抽提總RNA并做定量檢測，依據(jù)下述體系進行反轉(zhuǎn)錄，總體積為20 μL，其中dNTPs 1 μL，MMLV(反 轉(zhuǎn) 錄 酶 )1 μL，Oligo(dT)16 μL，Rnasin 0.4 μL，RNA 樣 品 2 μL，ddH2O 10.6 μL，5 ×MMLV酶反應緩沖液4 μL。將上述成分混勻后，37℃水浴2 h，95℃熱變性5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物－20℃保存。然后進行PCR，PCR反應體系總體積為25 μL，其中dNTPs 0.5 μL，ddH2O 7.8 μL，10×PCR反應緩沖液2.5 μL，Taq酶0.2 μL，cDNA 4 μL，IL-8RB或β-actin的上游引物5 μL，IL-8RB或β-actin的下游引物5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃預變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環(huán)，72℃再延伸8 min。分別以妊娠1 d、4 d、5 d、6 d小鼠子宮內(nèi)膜cDNA為模板，進行PCR。PCR產(chǎn)物分析：取5 μL DNA Marker、10 μL PCR產(chǎn)物點樣，2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓為90 V，電泳時間30 min，凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察電泳條帶，拍照。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計學處理

1.5.1 免疫組織化學圖像分析及統(tǒng)計學處理 用JeDa 801圖像分析系統(tǒng)測定各天妊娠小鼠子宮內(nèi)膜IL-8RB蛋白表達的相對含量，取6張不同孕鼠子宮內(nèi)膜切片，每張切片在光學顯微鏡下(×200)，于腔上皮、腺上皮和基質(zhì)的不同部位各自隨機測10個單位面積，IL-8RB蛋白相對含量用(±s)表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，用單因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD法處理，并進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.5.2 RT-PCR圖像分析及統(tǒng)計學處理 采用JeDa 801凝膠成像分析系統(tǒng)照像并利用相應的系統(tǒng)軟件對DNA條帶進行灰度掃描，將同一標本IL-8RB DNA條帶的灰度值/β-actin DNA條帶的灰度值作為相對光密度值，表示IL-8RB mRNA的相對含量，分別計算妊娠1 d、4 d、5 d、6 d小鼠子宮內(nèi)膜組織的平均光密度值(%)，用(±s)表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，用單因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD法處理，并進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學染色結(jié)果(圖1～4) IL-8RB蛋白主要定位在子宮內(nèi)膜的腔上皮細胞、腺上皮細胞的胞質(zhì)內(nèi)以及基質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，不同妊娠天數(shù)陽性反應強弱不等。藍紫色為Mayer蘇木精復染細胞核。妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中IL-8RB蛋白表達的半定量結(jié)果顯示(表1)：在子宮內(nèi)膜腔上皮，妊娠1 d陽性反應最弱，妊娠4 d表達最強，妊娠5 d有所下降，妊娠6 d降至妊娠1 d的水平，不同妊娠天數(shù)兩兩相比，除妊娠1 d與妊娠6 d二者比較無差異外，其余差異均有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；在子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)，隨妊娠天數(shù)增加IL-8RB的表達逐漸增強，其中妊娠5 d與妊娠6 d的腺上皮相比、妊娠4 d與妊娠5 d的基質(zhì)相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，其余兩兩相比，P＜0.01，差異均有高度統(tǒng)計學意義。

2.2 RT-PCR分析(圖5) IL-8RB和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物與理論長度一致，分別為509 bp和473 bp。IL-8RB mRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜組織中的半定量分析結(jié)果為：妊娠1 d表達最弱(0.108 6±0.021 8)，妊娠4 d表達最強(0.298 5±0.032 2)，妊娠5 d有所下降 (0.206 6±0.025 8)，妊娠6 d(0.110 3±0.022 4)降至妊娠1 d的水平，不同妊娠天數(shù)兩兩相比，除妊娠1 d與妊娠6 d二者比較無差異外，其余差異均有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1 IL-8RB蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜表達水平比較結(jié)果(±s)

表1 IL-8RB蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜表達水平比較結(jié)果(±s)

妊娠天數(shù) 腔上皮 腺上皮 基質(zhì)1 d 0.096±0.011 0.088±0.009 0.065±0.004 4 d 0.143±0.010 0.092±0.007 0.082±0.004 5 d 0.112±0.014 0.099±0.010 0.080±0.005 6 d 0.101±0.012 0.101±0.009 0.088±0.005

圖1 妊娠1 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達

圖2 妊娠4 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達

圖3 妊娠5 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達

圖4 妊娠6 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達

圖5 IL-8RB mRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達

3 討論

近年來，人們對IL-8在哺乳動物生殖生理過程中的作用研究取得一定進展，并且認為是IL-8與其相應的受體IL-8RBA或IL-8RB結(jié)合，從而趨化和激活中性粒細胞發(fā)揮作用[3-5]。1998年Iwabe等人[6]通過實驗證實在子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞中有IL-8R mRNA的表達，直到2003年Naciye M等人[2]才首次報道在正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞中均有IL-8RA和IL-8RB蛋白的表達。

需要特別指出的一點是，目前，關(guān)于IL-8RA和IL-8RB在著床前后子宮內(nèi)膜的表達情況國內(nèi)外研究的甚少，F(xiàn)rancisco Dominguez等人[7]在體外建立的植入模型中探討胚泡對于子宮內(nèi)膜趨化因子受體表達的影響，發(fā)現(xiàn)在沒有胚泡存在的情況下，僅為數(shù)很少的幾個子宮內(nèi)膜上皮細胞有幾乎不可測到的IL-8RA的表達；而在人類胚泡存在的情況下，IL-8RA陽性細胞不僅數(shù)量增加，而且染色的強度也相應增加。而對于IL-8RB的表達則未見表述。我們的實驗發(fā)現(xiàn)：IL-8RB無論是從蛋白水平還是從mRNA水平其在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達均呈時相性，妊娠1 d小鼠子宮內(nèi)膜處于分泌期，IL-8RB有表達，與Naciye M等人報道的結(jié)果一致[2]；小鼠胚泡的著床行為發(fā)生在妊娠4 d、5 d，這與IL-8RB在妊娠4 d達到高峰相符，妊娠5 d、6 d胚泡埋入子宮內(nèi)膜，IL-8RB表達回落。同時IL-8RB在腔上皮細胞中的表達趨勢與IL-8在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮表達趨勢相吻合[8]。mRNA的表達受到多重因素的復合調(diào)控，其與蛋白的表達很難同步[9-10]，本研究結(jié)果中IL-8RB mRNA與IL-8RB蛋白的表達規(guī)律基本趨于一致，在國內(nèi)外文獻中尚未見到報道。其趨于一致的變化規(guī)律是否穩(wěn)定還需科研工作者的進一步研究。從本文的研究結(jié)果，我們推測在胚泡著床過程中，腔上皮通過自分泌機制上調(diào)IL-8與IL-8RB的表達，IL-8與腔上皮細胞的IL-8RB直接結(jié)合，從而介導胚泡與子宮內(nèi)膜的相互作用。隨著胚泡植入子宮內(nèi)膜，IL-8RB在腺上皮細胞和基質(zhì)中的表達越來越強，我們認為IL-8與腺上皮和基質(zhì)中的IL-8RB直接結(jié)合，促使子宮內(nèi)膜基質(zhì)蛻膜化，為胚泡的植入創(chuàng)造有利的條件。此外，本研究所得到的IL-8RB mRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達規(guī)律與IL-8RB蛋白的表達相一致，這一結(jié)果填補了國內(nèi)外研究IL-8RB mRNA在著床前后子宮內(nèi)膜表達情況的空白。

綜上所述，IL-8RB在妊娠早期子宮內(nèi)膜的表達規(guī)律說明IL-8RB可能通過與其配體IL-8直接結(jié)合，參與小鼠胚泡的著床過程。當然著床是一個復雜的過程，起作用的不只是一個因子，而是由一些因子共同作用而精密調(diào)節(jié)的[11-12]，IL-8的受體-配體系統(tǒng)在胚泡著床中的具體作用值得深入研究。另外，IL-8RB在胚胎分化和發(fā)育過程中起何種作用也受到國內(nèi)外學者的重視[13-14]，檢測妊娠6 d以后IL-8RB的表達情況是深入研究的其中一個方向和分支。

[1]Hoch RC，Schtaufstaetter IU，Cochrane CG，et al.In vivo，in vitro，and moleculer aspects of interleukin-8 and interleukin-8 receptors[J].J Lab Clin Med，1996，128(2)：134-145.

[2]Naciye M，StevenFP，UmitAK，etal.Chemokine receptor expression in human endometrium[J].Biol Reprod，2003，68(5)：1491-1495.

[3]Garcia-Velasco JA，AriciA.Chemokinesandhuman reproduction[J].Fertil Steril，1999，71(6)：983-993.

[4]Manna SK，Sarkar A，Sreenivasan Y.α-melanocyte-stimulating hormonedown-regulatesCXC receptorsthrough activation of neutrophil elastase[J].Eur J Immunol，2006，36(3)：754-769.

[5]Dame JB，Juul SE.The distribution of receptors for the proinflammatory cytokines interleukin (IL)-6 and IL-8 in the developing human fetus[J].Early Human Development，2000，58(1)：25-39.

[6]Iwabe T，Harada T，Tsudo T，et al.Pathogenetic significance of increased levels of interleukin-8 in the peritoneal fluid of patientswith endometriosis[J].FertilSteril，1998，69(5)：924-930.

[7]Francisco Dominguez，Arancha Galan，Jose Juan Luna Martin，et al.Hormonal and embryonic regulation of chemokine receptors CXCR1，CXCR4，CCR5 and CCR2B in the human endometrium and the human blastocyst[J].Mol Hum Reprod，2009，19(4)：189-199.

[8]姜雯，宋芳，岳淑芬，等.白細胞介素-8在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達及對胚泡著床的影響[J].解剖學雜志，2005，28(6)：629-631.

[9]Noda A，Kinoshita K，Sakurai A，et al.Hyperglycemia and lipopolysaccharidedecreasedepression effectof interleukin 8 production by hypothermia：an experimental study with endothelial cells[J].Intensive Care Med，2008，34(1)：109-115.

[10]Li HP，Guo YJ，Zhu HS，et al.IL-8 mRNA expression in the mouse mammary glands during pregnancy and lactation[J].Genet Mol Res，2012，11(AOP)：353-361.

[11]Milne SA，Critchley HO，Drudy TA，et al.Perivascular interleukin-8 messenger ribonucleic acid expression in human endometrium varies across the menstrual cycle and in early pregnancy decidua[J].JClin EndocrinolMetab，1999，84(7)：2563-2567.

[12]ShiYL，LuoXZ，Zhu XY，etal.Effectsofcombined 17β-estradiol with TCDD on secretion of chemokine IL-8 and expression of its receptor CXCR2 in endometriotic focus-associated cells in co-culture[J].Hum Reprod，2006，21(4)：870-879.

[14]Caballero-Campo P，Dominguez F，Coloma J，et al.Hormonaland embryonicregulation ofchemokinesIL-8，MCP-1 and RANTES in the human endometrium during the window of implantation[J].Mol Hum Reprod ，2002，8(4)：375-384.

Objective To study the expression of IL-8RB in mRNA and protein in mouse endometrium during early pregnancy.Methods The expressions of IL-8RB in mouse endometrium on pregnant Day 1，Day 4，Day 5，and Day 6 were investigated by means of semi-quantitative RT-PCR，immunohistochemistry coloration method and image analysis techniques.Results Immunohistochemistry coloration results showed，in the luminal epithelium of endometrium，the expression of IL-8RB was the strongest on pregnant Day 4，then decreased gradually on Day 5，on Day 6 it reached the level of Day 1.In the glandular epithelium and stroma of endometrium，the expression of IL-8RB increased gradually with the pregnant progress.RT-PCR results showed the expression of IL-8RB mRNA was consistent with the expression of IL-8RB protein in the luminal epithelium of endometrium.Conclusion IL-8RB might take part in the process of mouse blastocyst implantation by combining with its ligand interleukin-8.

IL-8RB；Endometrium；Implantation；Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)；Immunohistochemistry

1005-619X(2012)12-1062-03

2012-10-22)