南方四季楊高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

王紅莉，蘇小曼，李甫金，羅建勛，辜云杰，宋 鵬

(1.成都市林木種苗站，四川 成都 610031;2.內(nèi)江市林業(yè)局，四川 內(nèi)江 641000;3.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081;4.平武縣林業(yè)局，四川 平武 522550)

南方四季楊為楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus L.)高大喬木，常綠/半常綠。其母本是美國(guó)密西西比州南方種源的美洲黑楊(P.deltoides Marsh.60/160)，父本是智利黑楊(P.nigra cv.Chile)。是國(guó)內(nèi)首選出的人工雜交雄性不育優(yōu)良無(wú)性系。從2002年先后引種到云南、重慶、江蘇南京、湖北、湖南、海南、上海、廣東深圳及陜西的漢中地區(qū)，主要作為城鄉(xiāng)園林綠化樹(shù)種、短周期纖維工業(yè)用材林和大徑級(jí)的膠合板材進(jìn)行推廣，2006通過(guò)四川省林木良種審定(認(rèn)定)委員會(huì)審定(良種編號(hào):川S-ETS-PDN-001-2006)。

該品種生長(zhǎng)快、樹(shù)干通直圓滿、耐水濕、木材基本密度大、抗風(fēng)折、落葉晚(比其他黑楊派楊樹(shù)晚落葉30 d～40 d)，在昆明、西昌、海南基本不落葉，翌年春天萌動(dòng)早，不飛花粉，不會(huì)對(duì)引種發(fā)展地構(gòu)成生態(tài)威脅。但是，南方四季楊在大量推廣過(guò)程中遇到的較嚴(yán)重蟲(chóng)害問(wèn)題，近年來(lái)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失，目前所采用的防治措施雖有一定的成效，但還是存在較大的局限性。加上雄性不育，不可能采用常規(guī)雜交育種進(jìn)行改良，只寄希望通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)改良其抗性。

本研究旨在建立南方四季楊組培體系的基礎(chǔ)上優(yōu)化南方四季楊遺傳轉(zhuǎn)化體系，擬將抗蟲(chóng)基因Cry3Aa導(dǎo)入南方四季楊的基因組中，減輕害蟲(chóng)對(duì)南方四季楊的危害，同時(shí)，為下一步通過(guò)基因工程手段改良該品種奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料、菌株及化學(xué)試劑

植物材料為南方四季楊無(wú)菌苗。

菌株為以超表達(dá)載體pBI121為載體的短肽融合的Cry3Aa(Bt基因)(中國(guó)林科院林業(yè)所盧孟柱課題組饋贈(zèng))帶有Cry3Aa目的基因的pBI121載體見(jiàn)圖1。

圖1 帶有Cry3Aa目的基因的pBI121載體

抗生素選擇卡那霉素(Kan)(用無(wú)菌水溶解，過(guò)濾滅菌)，利福平(Rif)(用二甲基甲酰胺溶解)、特美汀(TMT)(用無(wú)菌水溶解，過(guò)濾滅菌)，－20℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)細(xì)菌固體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):

(2)細(xì)菌液體培養(yǎng)基為不添加瓊脂的LB培養(yǎng)基;

(3)植物培養(yǎng)基(各培養(yǎng)基中均添加瓊脂5 g·L－1，蔗糖30 g·L－1，調(diào)節(jié) pH 至 5.8 ～6.0)

預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-BA0.25 mg·L－1+NAA0.09 mg·L－1;

篩選分化養(yǎng)基:MS+6-BA0.25 mg·L－1+NAA0.09 mg·L－1+Kan30 mg·L－1+TMT50 mg·L－1;

生根培養(yǎng)基:1/2MS+IBA0.05 mg·L－1+IAA0.1 mg·L－1+Kan30 mg·L－1+TMT50 mg·L－1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化

(1)菌株的活化

取保存于－80℃的菌株，冰上融化，用槍頭蘸取少量菌液在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上劃線，27℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。

(2)菌液的制備

從平板上挑取一個(gè)生長(zhǎng)飽滿的菌落，接種到含有相應(yīng)抗生素(Kan 30 mg·L－1，Rif(利福平)15 mg·L－1)的100 ml液體 LB 培養(yǎng)基中，27℃、230 rpm振蕩培養(yǎng)12 h，即可用于浸染。

1.2.2 外植體的選取

選取生長(zhǎng)健壯、顏色亮綠的組培苗，從頂端開(kāi)始的第3片～4片葉子，無(wú)菌條件下用手術(shù)刀片將葉片劃傷數(shù)刀。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)正負(fù)對(duì)照的設(shè)置

對(duì)照是指在既定條件下應(yīng)該出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果的實(shí)驗(yàn)參照，對(duì)照包括正對(duì)照和負(fù)對(duì)照。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)，正對(duì)照是指外植體不經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌浸染，也無(wú)卡那霉素等選擇壓力，直接放置于分化培養(yǎng)基上，讓其正常生長(zhǎng);負(fù)對(duì)照是指外植體不經(jīng)農(nóng)桿菌浸染，但是置于含有卡那霉素等抗生素的培養(yǎng)基(即和轉(zhuǎn)化外植體一樣的培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)。

1.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化程序

遺傳轉(zhuǎn)化程序包括以下5個(gè)主要步驟:預(yù)培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、抗性芽生根。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率受多個(gè)因子的影響，但要設(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)，把所有的因子及其交互作用對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響都包括在內(nèi)是一項(xiàng)巨大的工作。因此試驗(yàn)采取不考慮交互的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每次固定其它因子，只研究單因子變量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。

根據(jù)轉(zhuǎn)基因研究的一般情況，單因子變量為:預(yù)培養(yǎng)3 d，浸染時(shí)間5 min，浸染后26℃暗處共培養(yǎng)3 d。本實(shí)驗(yàn)共研究5個(gè)因子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。最終將5個(gè)因子的最佳條件組合，得出基本轉(zhuǎn)化條件。具體實(shí)驗(yàn)程序如下:

(1)選擇壓的篩選

卡那霉素濃度設(shè)置 0 mg·L－1，10 mg·L－1，20 mg·L－1，30 mg·L－1，40 mg·L－1，50 mg·L－1等 6個(gè)梯度。在南方四季楊不定芽分化培養(yǎng)基中加入上述濃度的卡那霉素，將無(wú)菌苗苗葉片切為0.5 cm大小，置于培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種3個(gè)培養(yǎng)皿，接種量以鋪滿培養(yǎng)皿空間為宜，均重復(fù)3次。半個(gè)月后觀察，確定南方四季楊葉片對(duì)卡那霉素的抗性濃度。

(2)影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的主要因素培養(yǎng)條件的篩選

①預(yù)培養(yǎng)時(shí)間:設(shè)置 0 d，1 d，2 d，3 d，4 d 等 4個(gè)梯度。

②浸染時(shí)間:設(shè)置 5 min，10 min，15 min，20 min，25 min等5個(gè)梯度。

③共培養(yǎng)時(shí)間:設(shè)置 0 d，1 d，2 d，3 d，4 d 等 5個(gè)梯度。

④共培養(yǎng)溫度:設(shè)置22℃，25℃，28℃3個(gè)梯度。

⑤乙酰丁香酮的影響:設(shè)置0 umol·L－1，100 umol·L－1，200 umol·L－1，300 umol·L－1，400 umol·L－15 個(gè)梯度。

以上實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理接種5個(gè)培養(yǎng)皿，根據(jù)培養(yǎng)皿的大小，每個(gè)培養(yǎng)皿接種6～12不等葉片數(shù)，均重復(fù)3次，分化率(%)=產(chǎn)生抗性芽的葉片數(shù)/接種的葉片總數(shù)×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel2007和SPASS軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇壓的選擇(抗生素Kan濃度的篩選)

轉(zhuǎn)基因過(guò)程中一個(gè)重要步驟就是陽(yáng)性植株的初步篩選，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕驑?gòu)建在載體pBI121上，根據(jù)該載體質(zhì)粒的特點(diǎn)，其上有對(duì)Kan有抗性的NPTⅡ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，因此，表達(dá)該基因的細(xì)胞對(duì)抗生素Kan會(huì)表現(xiàn)出抗性，在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠存活的再生芽初步被確定為轉(zhuǎn)化體。但是，不同植株對(duì)抗生素的敏感度不同，濃度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響到轉(zhuǎn)化效率，抗生素Kan的添加，既要能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，使之慢慢變黃、死亡，又不能影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)［1］。由于楊樹(shù)葉片對(duì)Kan十分敏感，而美洲黑楊及其雜種的不定芽再生非常困難［2，3］，因此，本實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置較小，選擇壓選擇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同卡那霉素(Kan)濃度對(duì)南方四季楊葉片分化的影響

由表1可以看出:實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著Kan濃度的增加，葉片分化率下降，褐化明顯急劇增加，20 mg·L－1時(shí)只有小部分分化，部分發(fā)黃，濃度≥30 mg·L－1時(shí)沒(méi)有分化芽產(chǎn)生。從上表可以看出，南方四季楊對(duì)Kan比較敏感，30 mg·L－1可以作為其臨界值。實(shí)驗(yàn)情況見(jiàn)圖2。

2.2 影響轉(zhuǎn)化效率的因素

2.2.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

關(guān)于浸染前預(yù)培養(yǎng)的必要性，因植物種類不同而異，大多數(shù)研究認(rèn)為:預(yù)培養(yǎng)是有必要的，主要原因包括兩點(diǎn):(1)減少外源污染。如果外植體被污染，在預(yù)培養(yǎng)中有可能被淘汰［1］;(2)有助于整合外源基因。預(yù)培養(yǎng)可使傷口周圍的細(xì)胞得以修復(fù)，傷口愈合過(guò)程中分泌的酚類物質(zhì)誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的Vir基因啟動(dòng);預(yù)培養(yǎng)可促進(jìn)細(xì)胞分裂，而處在分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA;在高滲透壓培養(yǎng)基上進(jìn)行外植體預(yù)培養(yǎng)還可以減少傷口處的細(xì)胞傷流液，使細(xì)胞內(nèi)的液泡減少并使細(xì)胞發(fā)生一定程度的質(zhì)壁分離，使農(nóng)桿菌易于接觸傷口周圍的細(xì)胞，從而提高轉(zhuǎn)化率［4］。不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，影響結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 Kan 濃度篩選(依次為 0，10，20 mg·L－1濃度)

表2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間條件下南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)南方四季楊抗性芽分化的影響

從表3可以看出，對(duì)于南方四季楊而言，沒(méi)有經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體產(chǎn)生抗性芽的概率為0，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間與抗性芽分化出現(xiàn)的頻率呈極顯著性相關(guān)，并且當(dāng)預(yù)培養(yǎng)3 d時(shí)，抗性芽產(chǎn)生頻率最高，達(dá)到11.48%。

2.2.2 浸染時(shí)間

浸染時(shí)菌液OD值和浸染時(shí)間都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，農(nóng)桿菌浸染時(shí)間過(guò)短，附著于外植體切口處的農(nóng)桿菌不足，抗性芽的產(chǎn)生頻率明顯降低，有時(shí)甚至無(wú)抗性芽產(chǎn)生，將大大降低轉(zhuǎn)化效率;但如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，褐化情況也會(huì)隨之嚴(yán)重［5，6］。

本實(shí)驗(yàn)將OD600統(tǒng)一為約0.4，研究浸染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。不同浸染時(shí)間對(duì)南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，影響結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 不同浸染時(shí)間條件下南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 不同浸染時(shí)間對(duì)南方四季楊抗性芽分化的影響

如表5所示，浸染時(shí)間與抗性芽分化出現(xiàn)的頻率呈極顯著性相關(guān)，當(dāng)侵染時(shí)間為10 min～15 min時(shí)，抗性芽產(chǎn)生頻率較高，當(dāng)侵染時(shí)間為20 min時(shí)，抗性芽產(chǎn)生頻率急劇下降，故應(yīng)將侵染時(shí)間該控制在15 min。

2.2.3 共培養(yǎng)時(shí)間

經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌浸染后，外源基因不會(huì)立即整合進(jìn)植物細(xì)胞，如果把外源基因插入T-DNA中，就有可能攜帶進(jìn)入受體植物并整合到染色體上。因此需要通過(guò)共培養(yǎng)為該過(guò)程提供充足的時(shí)間。但是，共培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基不添加任何抗生素，時(shí)間過(guò)短，后期引起污染的可能性較小，但是轉(zhuǎn)化率也會(huì)隨之降低;時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以提高整合外源基因效率，但是后期的農(nóng)桿菌污染可能無(wú)法控制。不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，影響結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 不同共培養(yǎng)時(shí)間條件下南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表7可以看出:共培養(yǎng)時(shí)間與抗性芽的分化呈顯著性關(guān)系，0 d～2 d的時(shí)間產(chǎn)生的分化芽很少，3d的培養(yǎng)時(shí)間，分化率達(dá)到最高，周圍有少量農(nóng)桿菌菌落，共培養(yǎng)4 d時(shí)有較大幅度的下降，并且葉片邊緣有明顯的農(nóng)桿菌產(chǎn)生。因此，初步認(rèn)定南方四季楊遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)時(shí)間為3 d。

2.2.4 共培養(yǎng)溫度

農(nóng)桿菌正常生長(zhǎng)的適宜溫度為28℃，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)共培養(yǎng)溫度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:只有22℃和25℃有抗性芽產(chǎn)生，并且數(shù)量很少，說(shuō)明共培養(yǎng)溫度在一定范圍內(nèi)(22℃ ～25℃)，對(duì)轉(zhuǎn)化效果影響不大。不同共培養(yǎng)溫度對(duì)南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，影響結(jié)果見(jiàn)表9。

表8 不同共培養(yǎng)溫度條件下南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9 不同共培養(yǎng)溫度對(duì)南方四季楊抗性芽分化的影響

從表9可以看出:本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果在一定范圍內(nèi)(22℃ ～25℃)，但同時(shí)也確定了南方四季楊轉(zhuǎn)化過(guò)程中，共培養(yǎng)溫度不宜過(guò)高。

2.2.5 乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

乙酰丁香酮(AS)的作用原理是其可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因活化，從而促進(jìn)外源基因的整合。本實(shí)驗(yàn)將乙酰丁香酮添加在浸染的菌液中，每隔5 min搖勻一次，使其與菌液中混合均勻，半個(gè)小時(shí)后浸染。菌液中添加不同濃度的AS對(duì)南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10，影響結(jié)果見(jiàn)表11。

從表11可以看出:實(shí)驗(yàn)結(jié)果AS的添加與抗性芽的分化關(guān)系不顯著，雖從數(shù)據(jù)來(lái)看，添加300umolL－1時(shí)，一定程度上可以提高轉(zhuǎn)化效率，但影響不大。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

確定了30 mg·L－1的Kan濃度作為南方四季楊遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的選擇壓;

表10 菌液中添加不同濃度的AS條件下南方四季楊抗性芽分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表11 菌液中添加不同濃度的AS對(duì)南方四季楊抗性芽分化的影響

南方四季楊遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中優(yōu)化后條件是:葉盤法，預(yù)培養(yǎng)3 d;OD600=0.4的菌液浸染10 min～15 min;浸染前菌液中加入 AS300 μmol·L－1;22℃～25℃條件下暗處共培養(yǎng)3 d。

3.2 討論

一直以來(lái)，楊樹(shù)作為木本植物中的模式植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究。但是同一屬的不同種影響表現(xiàn)還是有很大區(qū)別的。本實(shí)驗(yàn)研究的是南方四季楊，選取了遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的5個(gè)主要因素進(jìn)行研究。

Confalonieri等轉(zhuǎn)化歐洲黑楊(P.nigra L.)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:無(wú)預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)1 d對(duì)其轉(zhuǎn)化率沒(méi)有顯著影響［7］;Confalonieri等研究歐美楊(P.euramericana Neva.)和美洲黑楊(P.deltoids Marsh.)時(shí)預(yù)培養(yǎng)24 h［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的預(yù)培養(yǎng)天數(shù)為3 d，與前人研究同一派楊樹(shù)的結(jié)果差異較大，并且不同濃度間差異極顯著，有待于進(jìn)一步觀察了解預(yù)培養(yǎng)階段植物體內(nèi)部發(fā)生的微小變化，分析總結(jié)出具體原因所在。

浸染時(shí)菌液OD值和浸染時(shí)間亦會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，Leple等用OD600=0.3的菌液浸染楊樹(shù)雜種(P.tremula L. × P.alba L.)16 min［9］;郝貴霞認(rèn)為用OD600=0.2～0.4的菌液浸染究毛白楊(P.tomentosa Carr.)時(shí)間應(yīng)保持在10 min ～20 min［10］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為15 min，與前人相關(guān)方面的研究結(jié)果基本一致。

在歐洲黑楊遺傳轉(zhuǎn)化研究中，Confalonieri等認(rèn)為共培養(yǎng)48h最佳［7］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:共培養(yǎng)2 d時(shí)，分化芽很少，但3 d，分化芽迅速增多。

有研究報(bào)道:用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化菜豆和煙草的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)溫度超過(guò)22℃時(shí)，報(bào)告基因的表達(dá)大大下降，27℃時(shí)特別低，29℃時(shí)就完全檢測(cè)不出了［11］。但也有報(bào)道顯示水稻轉(zhuǎn)愈傷組織轉(zhuǎn)化中共培養(yǎng)溫度在37℃時(shí)轉(zhuǎn)化率較高［12］。南林895的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，得出的結(jié)果是轉(zhuǎn)化頻率最高的28℃，說(shuō)明較高的溫度更有利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化［13］。因此，不同植物共培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)溫度的需求差異是較大的，本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果與 Dillenw［11］的研究基本一致。但是，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的溫度范圍較小，更低的溫度是否更有利于提高轉(zhuǎn)化效率，有待于進(jìn)一步研究。

新疆楊的研究中，添加乙酰丁香酮的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率都明顯高于對(duì)照，最適濃度為 80 μmol·L－1，濃度過(guò)高，則轉(zhuǎn)化率反而下降［14］。楊屬內(nèi)常用的乙酰丁香酮添加濃度為 200 μmol·L－1［5，11］，濃度較低，其原因有三:首先乙酰丁香酮是一種植物受傷后分泌的酚類物質(zhì);其次楊樹(shù)是農(nóng)桿菌的天然宿主［9］，細(xì)胞受傷后本身就有酚類物質(zhì)的分泌;最后，乙酰丁香酮對(duì)農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)可能不利。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論結(jié)果存在一定偏差，可能是由于植物本身的特殊性，也有可能是乙酰丁香酮添加的時(shí)間所造成的，前人大多數(shù)是添加進(jìn)培養(yǎng)基中，而本實(shí)驗(yàn)添加于浸染的菌液中，至于哪種添加效果明顯還有待于進(jìn)一步對(duì)比研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于黑楊派楊樹(shù)而言，本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果差異表現(xiàn)較大的是預(yù)培養(yǎng)天數(shù)和乙酰丁香酮的添加。其中，乙酰丁香酮的添加與大多數(shù)研究結(jié)論相反，關(guān)于乙酰丁香酮的作用原理有待于進(jìn)一步研究。

另外，影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素還有很多:乙酰丁香酮的添加時(shí)機(jī)、菌液制備方法、培養(yǎng)基pH值以及葉片放置方法等。要想取得最高轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各個(gè)因素都要進(jìn)行優(yōu)化，并且這些因素各自不是單獨(dú)存在的，需要考慮個(gè)因素之間的交互作用，這樣一來(lái)，要設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，工作量是相當(dāng)大的。因此，本實(shí)驗(yàn)選取幾個(gè)重要的因素進(jìn)行優(yōu)化，得出了較優(yōu)遺傳轉(zhuǎn)化體系。

葉盤法轉(zhuǎn)化過(guò)程中，抗性芽的篩選是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，能夠在含有一定劑量的抗生素培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體被初步確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。本實(shí)驗(yàn)所有生根的抗性芽中，陽(yáng)性植株所占的比例很低，很大原因是在抗性芽生根的過(guò)程中，采用的選擇壓太小。在最優(yōu)條件下，南方四季楊遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4和圖5。

圖3 葉片分化前

圖4 抗性芽分化

圖5 抗性芽生根

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