卵巢腫瘤干細(xì)胞中趨化因子的表達與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系

李 青 汪 艷 張 曦 朱慧芬 唐良萏

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽安慶 246000

卵巢腫瘤干細(xì)胞中趨化因子的表達與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系

李 青1,2汪 艷2張 曦2朱慧芬2唐良萏1▲

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽安慶 246000

目的探討卵巢腫瘤干細(xì)胞中趨化因子的表達與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，為卵巢腫瘤的治療提供新的研究思路和藥物作用靶點。 方法 采用流式細(xì)胞術(shù)與RT-PCR方法檢測卵巢腫瘤干細(xì)胞系CAOV-3中CXCR4的表達，通過體外微孔隔離室（Transwell）檢測CXCR4對CAOV-3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。 結(jié)果 CXCR4在CAOV-3中細(xì)胞呈陽性表達，CXCL12可促進CAOV-3細(xì)胞的遷移，CXCR4的封閉能抑制CXCL12對CAOV-3遷移的促進作用。 結(jié)論CXCL12-CXCR4相互作用可促進卵巢腫瘤干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，在卵巢腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。

卵巢腫瘤干細(xì)胞；CXCL12；CXCR4；CAOV-3；侵襲轉(zhuǎn)移

▲通訊作者：唐良萏，教授，博士生導(dǎo)師。

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展與環(huán)境的各種影響，當(dāng)前我國卵巢腫瘤發(fā)病率越來越高，并且預(yù)后嚴(yán)重。2009年有調(diào)查顯示，我國卵巢腫瘤死亡率居女性生殖道惡性腫瘤之首。眾所周知，卵巢腫瘤一個很重要的特征就是容易發(fā)生細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移特性除了與患者自身原因有關(guān)外，卵巢腫瘤干細(xì)胞中的趨化因子發(fā)揮了重要的作用[1]。已有研究表明多種趨化因子可在卵巢惡性腫瘤中高表達，如近年研究較多且作用較肯定的有白細(xì)胞介素8（IL-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1（MIP-1）等。 CXCR4（CXC chemokinereceptor 4）是一種趨化因子受體，能在卵巢腫瘤干細(xì)胞上特異表達，是當(dāng)前研究的14個趨化因子受體中唯一在卵巢腫瘤干細(xì)胞上表達的；趨化因子CXCL12族（過去又稱SDF-1，stromal cell derived factor-1）與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的復(fù)合體在多卵巢腫瘤的分布與侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[2]。本研究從體外實驗水平探討卵巢腫瘤干細(xì)胞CXCR4表達變化對卵巢腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，希望為卵巢腫瘤的治療提供新的研究思路和藥物作用靶點。

1 資料與方法

1.1 卵巢腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)

本實驗所用CAOV-3卵巢細(xì)胞株和Anglne細(xì)胞株分別購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所與北京微生物所，將細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)24 h，確保細(xì)胞數(shù)不少于1×104個。

1.2 卵巢腫瘤干細(xì)胞穩(wěn)定表達CXCR4體系的建立

取 2×107細(xì)胞，PBS（磷酸鹽緩沖液）洗 2 次，SIGMA Trizol試劑盒一步法提取卵巢腫瘤干細(xì)胞總RNA。Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），以tubulin作為內(nèi)參照，取2.5 μL反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙啶染色，紫外光檢測儀觀察PCR合成結(jié)果。引物（北京三博合成）：正向 5’-TACCATGCCAGGGGATCA-3’，反向 5’-CTTGGCCTGTGACTGTT-3’，PCR 產(chǎn)物長度約為450 bp。同時也采用免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析法檢測卵巢腫瘤干細(xì)胞CXCR4的表達。

1.3 趨化活性檢測

本組卵巢腫瘤干細(xì)胞達CXCR4體系趨化活性檢測采用Transwell分析：細(xì)胞穩(wěn)定生長至70%～90%融合時，PBS清洗兩遍，然后用無血清培養(yǎng)液把多細(xì)胞組合培養(yǎng)成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞，PBS清洗濃度調(diào)至1×106細(xì)胞/mL。將Transwell侵襲小室放入24孔板內(nèi)，卵巢腫瘤干細(xì)胞接種于Transwell侵襲小室的上室，每上室加0.2 mL單細(xì)胞懸液，下室加0.4 mL無血清培養(yǎng)液，然后分為5組：（1）上室為包含單細(xì)胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室純?yōu)闊o血清培養(yǎng)液。（該組為對照組）（2）上室為包含單細(xì)胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室包含CXCL12（濃度為10 ng/mL）的無血清培養(yǎng)液。（3）上室為包含單細(xì)胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室為包含CXCL12（濃度為100 ng/mL）的無血清培養(yǎng)液。（4）上室為包含CXCR4中和抗體（濃度為10 μg/mL）的無血清培養(yǎng)液，下室為包含CXCL12（濃度為10 ng/mL）的無血清培養(yǎng)液。（5）上室為包含CXCR4拮抗劑AMD3100（濃度為10 μg/mL）和單細(xì)胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室為包含CXCL12（濃度為100 μg/mL）的無血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)后將上面5種方法培養(yǎng)后的細(xì)胞用PBS沖洗2次，棉拭子擦去未侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，無菌風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，然后用自來水沖洗干凈。400倍顯微鏡下每張切片隨機記錄3個視野的侵襲轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)，然后進行平均統(tǒng)計，觀察CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較應(yīng)用 χ2檢驗，P ＜ 0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4的表達

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示，CAOV-3卵巢細(xì)胞株表達中等量的CXCR4分子，RT-PCR則進一步證實該細(xì)胞存在一定量的CXCR4分子的轉(zhuǎn)錄。而在Anglne細(xì)胞中CXCR4無表達。具體情況見圖1。

2.2 CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

對于CAOV-3/CXCR4細(xì)胞來說，當(dāng)Transwell小室的下室中加入10 ng/mL的CXCL12時，發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)與對照組相比增多（P＜0.05）；100 ng/mL CXCL12加入使侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)更明顯增多（P＜0.05），也明顯高于10 ng/mL CXCL12組；不過當(dāng)上室加入10 ng/mLCXCR4中和抗體或10 μg/mL CXCR4拮抗劑AMD3100時，能抑制CXCL12對卵巢腫瘤干細(xì)胞的趨化性侵襲轉(zhuǎn)移 （P＜0.05），同時拮抗劑AMD3100加入時下降趨勢更加明顯（P＜0.05）。具體情況見表1。

3 討論

眾所周知，腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、微觀的、多信號的連續(xù)多階段過程，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過程涉及腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生、成熟、運動、侵襲、轉(zhuǎn)移、黏附和消亡。與其他多種類型的腫瘤細(xì)胞不同，卵巢腫瘤干細(xì)胞具有獨特的侵襲轉(zhuǎn)移規(guī)律，這種轉(zhuǎn)移特性除了與患者自身原因有關(guān)外，卵巢腫瘤干細(xì)胞中的趨化因子發(fā)揮了重要的作用[3]。

表1 CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響（±s）

表1 CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與10 ng/mL CXCL12組相比，#P＜0.05；與100 ng/mL CXCL12組相比，△P＜0.05

項目 對照組 10 ng/mL CXCL12組 100 ng/mL CXCL12組 CXCR4抗體組 AMD3100組CAOV-3 CAOV-3/CXCR4 185.62±8.56 226.01±15.96 175.62±15.12 249.21±13.21*178.62±17.10 581.62±16.32#178.12±18.21 246.21±15.24△169.25±18.32 145.26±30.02△

趨化因子（chemokines）是一類具有趨化作用的細(xì)胞因子，是指具有吸引白細(xì)胞移行到感染部位的一些低分子量趨化因子（多為 8-10KD）的蛋白質(zhì)（如 IL-8、MCP-1等），在炎癥反應(yīng)中具有重要作用[4]。趨化因子的主要作用是趨化細(xì)胞的遷移，細(xì)胞沿著趨化因子濃度增加的信號向趨化因子源處的遷徙[5]。有些趨化因子在免疫監(jiān)視過程中控制免疫細(xì)胞趨化，如誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞到淋巴結(jié)。有些趨化因子在發(fā)育中起作用；他們能刺激新血管形成；提供具體的關(guān)鍵信號而促成細(xì)胞成熟。其他趨化因子可以因應(yīng)對細(xì)菌感染、病毒感染由多種細(xì)胞釋放；也可以因非感染性的刺激如二氧化硅吸入，尿路結(jié)石等而釋放。炎性趨化因子的主要作用是趨化白細(xì)胞從血循環(huán)到感染或組織損傷部位。有的趨化因子也可以促進傷口愈合[6]。

CXCR4是白細(xì)胞中的一種受體，在免疫系統(tǒng)中起著調(diào)整細(xì)胞運動的重要作用。當(dāng)前大量的研究提示CXCR4有可能在腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。Vanderbilt-Ingram癌癥中心的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，CXCR4作為受體，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的擴散過程中扮演著極其關(guān)鍵的角色[7]。但研究者們也表示，阻止CXCR4發(fā)揮受體的功能，雖然能大大削弱癌細(xì)胞擴散的能力，但不能完全制止它們的擴散。國外還有研究顯示約80%卵巢腫瘤組織中有CXCL12的受體CXCR4的表達，在95%卵巢腫瘤腹水中發(fā)現(xiàn)CXCL12，而在正常卵巢上皮中卻沒有表達[8]。2010年10月8日報道，美國科學(xué)家在最新出版的《科學(xué)》雜志報告稱，他們獲得了CXCR4分子結(jié)構(gòu)的圖像，也了解了該分子的工作原理[9]。研究顯示，CXCR4分子同艾滋病病毒（HIV）感染和癌癥擴散有關(guān)，該分子會幫助HIV進入細(xì)胞，因此，阻斷該分子有望治療艾滋病和癌癥。一般而言，CXCR4也有助于激活免疫系統(tǒng)并且刺激細(xì)胞運動，但是，當(dāng)激活受體的信號沒有被正確調(diào)制時，CXCR4會加速癌癥的惡化和擴散[7]。本文流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示，CAOV-3卵巢細(xì)胞株表達中等量的CXCR4分子，RT-PCR則進一步證實該細(xì)胞存在一定量的CXCR4分子的轉(zhuǎn)錄。而在Anglne細(xì)胞中CXCR4無表達[10]。

判斷腫瘤干細(xì)胞惡性程度最準(zhǔn)確的指標(biāo)就是細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，本文以Transwell侵襲小室為模型，發(fā)現(xiàn)CXCL12能夠促進CAOV-3/CXCR4細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移 （P＜0.05）；同時高濃度CXCL12加入使侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)更明顯增多（P＜0.05），也明顯高于10 ng/mL CXCL12組；不過當(dāng)上室加入10 ng/mL CXCR4中和抗體或10 μg/mL CXCR4拮抗劑AMD3100時，能抑制CXCL12對卵巢腫瘤干細(xì)胞的趨化性侵襲轉(zhuǎn)移（P＜0.05），同時拮抗劑AMD3100加入時下降趨勢更加明顯（P＜0.05）。表明CXCL12-CXCR4生物軸對卵巢腫瘤干細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有重要的影響。

總之，CXCL12-CXCR4相互作用可促進卵巢腫瘤干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，在卵巢腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。因此我們推斷抑制腫瘤細(xì)胞表面CXCR4的表達，干擾CXCL12-CXCR4的相互作用可能是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的一個有意義的研究思路和藥物作用靶點。同時本研究成功構(gòu)建高表達CXCR4的卵巢腫瘤干細(xì)胞株CAOV-3/CXCR4，為后續(xù)研究提供平臺和工具。

[1]Taichan RS，Cooper C，Keller ET，et al.Use of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 pathway in prostate cancer metastasis to bone[J].Cancer Res，2002，62（2）：1832-1837.

[2]Burger M，Glodek A，Hartmann T， et al.Functional expression of CXCR4（CD184）on small-cell lung cancer cells mediates migration，integrin activation and adhesion to stromal cells[J].Oncogene，2003，22 （6）：8093-8101.

[3]Zeelenberg IS，Ruuls-Van Stalle L， Roos E，et al.The chemokine receptor CXCR4 is required for outgrowth of colon carcinoma micrometastases[J].Cancer Res，2003，63（13）： 3833-3839.

[4]Kijima Z，Maulik G,Ma PC，et al.Regulation of cellular proliferation，cytoskeletal function，and signal transduction through CXCR4 and-c-Kit in small cell lung cancer cells[J].Cancer Res，2002，62（21）：6304-6311.

[5]Jiang YP,Wu XH，Shi B，et al.Expression of chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 in human epithelial ovarian cancer：An independent prognostic factor for tumor progression[J].Gynecol Oncol，2006，103（1）：226-233.

[6]王曉翊，盧實，林曉琰，等.SDF-1/CXCR4對卵巢上皮性癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2008，17（4）：254-258.

[7]王琪，張瑋，黎丹戎，等.兩種卵巢惡性腫瘤潛在血清標(biāo)記物的純化鑒定及臨床驗證[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，15（9）：1012-1016.

[8]Antoine WT，Robbert V，Linda MP，et al.Novel insights in the regulation of CCLl 8 secretion by monocytes and dendritic cells via cytokines，Toll-like receptors and rheumatoid synovial fluid[J].BMC Immunol，2006，7（23）：1-12.

[9]Beili Wu,Ellen Y.T.Chien,Clifford D，et al.Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists[J].Science,2010,10（11）：26-30.

[10]Alfonso P，Latre P，Bias I.Clinical Evaluation of CCLl8/PARC and Chitotriosidase Biomarkers in Gaucher Disease[J].Blood（ASH Annual Meeting Abstracts），2005，106（2）：3885-3890.

The relation of chemokine expression and cell invasion and metastasis in the ovarian cancer stem cells

LI Qing1,2WANG Yan2ZHANG Xi2ZHU Huifen2TANG Liangdan1

1.Department of Obstertrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Department of Obstertrics and Gynecology,the Affiliated Anqing Hospital of Anhui Medical University,Anqing 246000,China

ObjectiveTo investigate the ovarian tumor stem cells chemokine expression and cell invasion and metastasis ability of relation,for the treatment of ovarian tumors to provide new research ideas and targets of drug action.Methods Expression of CXCR4 in ovarian cancer cellline CAOV-3 was detected by reverse transcriptase—polymerase chain reaction(RT-PCR)and flow cytometry;Transwell was used to analyze the invasion and metastasis of CAOV-3 cells in presence of CXCL12 or when CXCR4 was blocked by anti-CXCR4.Results CXCR4 in CAOV-3 cells showed positive expression,CXCL12 induced the invasion and metastasis of CAOV-3 cells，which could be effectively blocked by anti-CXCR4.Conclusion CXCL12-CXCR4 interactions may promote ovarian tumor stem cells invasion and metastasis,in ovarian tumor growth and metastasis plays an important role in the process.

Ovarian cancer stem cells;CXCL12;CXCR4;CAOV-3;Invasion and metastasis

R737.31

A

1674-4721（2012）06（a）-0010-03

安徽省2010年度第四批科技計劃項目（10020503083）。

李青（1970-），男，在讀博士，副主任醫(yī)師。

2012-05-14 本文編輯：馬 雙）