轉(zhuǎn)化生長因子β1和Smad4蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及其意義

馬洪波，黃 濤，韓 風(fēng)，陳偉瑜

我國約有90%的肝癌患者具有乙型肝炎背景，部分患者存在丙型肝炎病毒 (HCV)、乙型肝炎病毒 (HBV)以及丁型肝炎病毒 (HDV)的重疊感染，其在經(jīng)過長期的慢性炎癥后可逐漸演變?yōu)楦斡不取，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β1－抑癌基因 (TGF－β1－Smad)信號通路在肝纖維化、肝炎、肝硬化過程中扮演著重要角色，是目前分子生物學(xué)研究的熱點之一［1］。Smad4蛋白由DPC4基因編碼，是一類對TGF－β1信號起轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的胞質(zhì)信號級聯(lián)效應(yīng)分子，具有受體激活型效應(yīng)的Smad(R－Smad)受到信號刺激后會發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致蛋白自身的構(gòu)象發(fā)生變化并與同型的Smad4蛋白相互結(jié)合而形成寡聚體，寡聚體轉(zhuǎn)位入核之后則參與調(diào)控很多靶基因的表達(dá)，發(fā)揮TGF－β1－Smad信號通路的調(diào)控效應(yīng);而抑制型的Smad(I－Smad)也必須和Smad4蛋白進行相互作用后才可抑制TGF－β1信號向下一級傳遞［2－3］。DPC4基因所編碼的蛋白即Smad4蛋白對整個TGF－β1－Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起關(guān)鍵作用，該基因的表達(dá)異常會引發(fā)細(xì)胞無限增殖的現(xiàn)象，研究TGF－β1與Smad4蛋白在肝癌組織中的表達(dá)具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年3月—2011年4月我院收治的肝癌患者54例，其中男31例，女23例，年齡24～67歲，平均44.9歲。腫瘤分期:Ⅰ期14例，無顯著肝癌癥狀和體征;Ⅲ期19例，有腹腔積液、黃疸、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、惡液質(zhì)癥狀之一;Ⅱ期21例，癥狀介于Ⅰ期與Ⅲ期之間?；颊叩母伟┙M織均在術(shù)后冷凍保存?zhèn)溆?同時選取患者的癌旁組織分別編號冷凍后備用。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 濃縮型兔抗人TGF－β1和Smad4蛋白單克隆抗體均購自Sigema公司，工作濃度為1∶200。原位雜交檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)試劑盒、鏈霉親和素－過氧化復(fù)合物 (ABC)等購自羅氏公司。

1.2.2 實驗方案 采用原位雜交顯色法 (IHCABC法)，TGF－β1以及Smad4一抗工作濃度均為1∶200，行DAB顯色及常規(guī)原位雜交 (ISH)。以磷酸鹽緩沖液 (PBS)為陰性對照，以有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織作為陽性對照。蛋白質(zhì)原位雜交與RNA原位雜交按照《分子克隆實驗指南》［4］進行。對肝癌組織及癌旁組織Smad4 mRNA和Smad4蛋白表達(dá)量進行分析，確定肝癌組織及癌旁組織中DPC4基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上是否存在差異，即Smad4 mRNA和Smad4蛋白的差異。若存在差異 (已經(jīng)預(yù)實驗證實)，則進一步探討Smad4蛋白與TGF－β1的相關(guān)性，尋找二者的關(guān)系。

1.3 結(jié)果判定 在400倍光鏡下隨機選取8個視野進行拍照，胞質(zhì)及胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性細(xì)胞的結(jié)構(gòu)必須清晰，著色明顯且定位準(zhǔn)確，計算陽性染色面積所占比例，陽性細(xì)胞面積占總面積的80%及以上計4分;占總面積的50%～79%計3分;占總面積的10%～49%計2分;小于總面積的10%計1分;不著色為陰性，計0分。同時進行光密度半定量分析，并求得其平均值，按陽性信號的強度計分，陰性計0分，弱陽性計2～3分，中度陽性計4～5分，強陽性計6～7分。陽性面積評分和信號強度評分的乘積為總分，總分≤5分為低表達(dá)，＞5分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以 (±s)表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表達(dá)和半定量結(jié)果 Smad4蛋白在肝癌組織中高表達(dá)21例，高表達(dá)率為38.9%;癌旁組織中高表達(dá)25例，高表達(dá)率為46.3%，兩種組織中Smad4蛋白高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=16.59，P=0.01);Smad4 mRNA在肝癌組織中高表達(dá)28例，高表達(dá)率為51.9%;癌旁組織中高表達(dá)36例，高表達(dá)率為66.7%，兩種組織中Smad4 mRNA高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=7.83，P=0.01)。肝癌組織中Smad4蛋白陽性面積與癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，光密度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);肝癌組織中Smad4 mRNA陽性面積和光密度值與癌旁組織比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 肝癌組織及癌旁組織中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表達(dá)和半定量結(jié)果 (±s，n=54)Table 1 The expression and semi－quantitative results of Smad4 gene and Smad4 mRNA in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues

表1 肝癌組織及癌旁組織中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表達(dá)和半定量結(jié)果 (±s，n=54)Table 1 The expression and semi－quantitative results of Smad4 gene and Smad4 mRNA in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues

組織類型 陽性面積 (μm2)Smad4蛋白Smad4 mRNA肝癌組織 32.93±17.62 26.53±13.51 0.11±0.01 0.17±0.01 Smad4 mRNA光密度Smad4蛋白癌旁組織 33.14±15.97 45.12±15.27 0.22±0.01 0.26±0.01 t 0.97 17.93 9.71 11.64 P值值0.62 0.01 0.02 0.01

2.2 肝癌組織中TGF－β1表達(dá)和Smad4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織中TGF－β1和Smad4蛋白高表達(dá)率在男女間，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);以45歲為界，肝癌組織中TGF－β1和Smad4蛋白高表達(dá)率在不同年齡間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);在不同病理分期間比較，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，且隨著病理分期增加，TGF－β1和Smad4蛋白高表達(dá)率明顯升高 (見表2)。

表2 肝癌組織中TGF－β1表達(dá)和Smad4蛋白表達(dá)與病理特征的關(guān)系〔n(%)，n=54〕Table 2 Relationship between the expression of TGF－β1and Smad4 protein in HCC tissues and clinical pathological features

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因表達(dá)共同變化的過程，主要與癌基因的激活及抑癌基因的失活或受抑制有關(guān)，細(xì)胞增殖和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在其中扮演著重要角色［5－6］。TGF－β1對細(xì)胞的調(diào)控機制非常復(fù)雜，主要通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來完成，在這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有TGF－β1以及相關(guān)受體蛋白尤其是Smad蛋白家族參與。這些作用分子的功能及狀態(tài)影響著細(xì)胞對生長調(diào)節(jié)信號的傳導(dǎo)、應(yīng)答及反饋。TGF－β1參與細(xì)胞的多種基因調(diào)控，是很多與腫瘤組織生長有關(guān)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在人體細(xì)胞分化以及惡性腫瘤行為中具有重要作用。DPC4基因是在上個世紀(jì)由Hongmei等［7］發(fā)現(xiàn)的新型抑癌基因，是TGF－β1－Smad信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可看做是一個中心分子。而Smad 4蛋白能夠與Smad家族成員的任意一種發(fā)生相互作用，一旦DPC4基因發(fā)生缺失、突變或沉默，將導(dǎo)致其功能喪失，進而導(dǎo)致整個信號通路甚至整個細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂，最終形成腫瘤［8］。受 DPC4基因調(diào)控的下游基因有 p21、TSP1等。p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制物，能夠抑制CDK與細(xì)胞周期蛋白形成復(fù)合物，并使細(xì)胞生長停留在G1期，進而調(diào)控細(xì)胞的分裂增殖。其他下游基因主要調(diào)控一些細(xì)胞的增殖分化、凋亡以及血管生成。胃癌、胰腺癌、乳腺癌等均與DPC4基因的缺失和突變有關(guān)，TGF－β1－Smad信號通路對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展極其重要［10－12］。

本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中Smad4蛋白高表達(dá)率和半定量結(jié)果均低于癌旁組織，說明肝癌細(xì)胞內(nèi)部DPC4基因呈低表達(dá)甚至不表達(dá)，使得TGF－β1－Smad信號通路受阻，進而導(dǎo)致機體對肝癌細(xì)胞的分裂、分化和增殖失去控制。如果肝癌細(xì)胞能重新正常表達(dá)DPC4基因，可能會有效地抑制肝癌的進一步發(fā)展。肝癌組織中TGF－β1和Smad4蛋白高表達(dá)與患者性別無關(guān)，而與病理分期和年齡增長 (≥45歲)有關(guān)。但本研究樣本例數(shù)有限，所采用的方法本身存在一定的局限性，只能揭示Smad4蛋白在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)特征，要想得到Smad4蛋白與肝癌發(fā)生關(guān)系的直接證據(jù)，需構(gòu)建DPC4基因表達(dá)載體，進一步研究其在肝癌組織中的病理變化，深入探討TGF－β1和Smad4蛋白的作用。

1 Samarakoon R，Chitnis SS，Higgins SP，et al.Redox－ induced Src kinase and caveolin－1 signaling in TGF－β1－initiated SMAD 2/3 activation and PAI－ 1 expression ［J］.PLoS One，2011，6(7):e22896.

2 Wang QL，Tao YY，Yuan JL，et al.Salvianolic acid B prevents epithelial－to－mesenchymal transition through the TGF－beta1signal transduction pathway in vivo and in vitro ［J］.BMC Cell Biol，2010，11:31.

3 Mickey M，Martin，Jessica A，et al.Elton TGF － β1stimulates human AT1 receptor expression in lung fibroblasts by cross talk between the Smad，p38 MAPK，JNK，and PI3K signaling pathways［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293(3):L790 －L799.

4 黃培堂譯.分子克隆實驗指南 (上下冊) ［M］.科學(xué)出版社，2005:1012－1633.

5 Piyali Mukherjee，Sherry L，Winter，et al.Cell cycle arrest by transforming growth factor β1near G1/S is mediated by acute abrogation of prereplication complex activation involving an Rb－MCM interaction［J］.Mol Cell Biol，2010，30(3):845 －856.6 Huang WC，Yen FC，Shie FS，et al.TGF －β1blockade of microglial chemotaxis toward Aβ aggregates involves SMAD signaling and downregulation of CCL5 ［J］.J Neuroinflammation，2010，7:28.

7 Hongmei Peng，Oscar A，Carretero，et al.Ac－ SDKP inhibits transforming growth factor－β1－induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(5):H1357－H1364.

8 陳國平，夏立平.TGF－β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腫瘤的關(guān)系［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，15(1):91.

9 夏立平，劉曉力，陳國平，等.TGF－β1、TGF－βR1、Smad4在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相互關(guān)系［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，16(6):693－698.

10 丁平，宋炳紅，朱利敏，等.TGF－β/Smad4基因信號通路對結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞株轉(zhuǎn)移潛能影響的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18(19):1519－1521.

11 程朋，曾維政，蘇曉妹，等.TGFβ1與Smad4基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義 ［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2009，14(7):609－613.

12 陳桂敏，王少賢.肝纖維化TGF－β1/smad信號通路中醫(yī)藥研究進展［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，16(6):810－812.